复合添加剂对斜带石斑鱼生长、免疫和肠道形态的影响

赵转转 杨红玲 赵 芸 汪 攀， 朱传忠 孙云章

（1．集美大学水产学院 厦门市饲料检测与安全评价重点实验室，福建 厦门 361021；2．福建大北农华有水产科技集团有限公司，福建 漳州 363500）

本课题组前期从石斑鱼肠道筛选到一株益生菌——短小芽孢杆菌SE5，饵料中添加SE5（1.0×108CFU/g）能够有效提高斜带石斑鱼饲料效率，改善免疫功能，调节肠道菌群平衡[7-8]。益生菌和益生元组合成的饲料添加剂为合生素，其功效往往优于单独添加益生元或益生菌[9-10]。丁酸是在肠道中存在的一种短链脂肪酸，可为肠上皮细胞生长发育直接供能，但丁酸半衰期很短，极易挥发，不适合在饲料中直接添加[11]。三丁酸甘油酯半衰期长，安全无毒副作用，被肠道胰脂肪酶水解后产生3个分子的丁酸，是动物良好的丁酸来源。本课题组前期研究发现，不同梯度果寡糖（FOS）能够提高斜带石斑鱼的生长性能、免疫力和肠道健康[12-13]。本研究在此基础上，探究不同梯度果寡糖添加短小芽孢杆菌（SE5）和三丁酸甘油酯（Tb）对斜带石斑鱼生长、免疫和肠道形态的影响，为复合添加剂的开发利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

斜带石斑鱼幼鱼购自厦门小嶝岛某石斑鱼育苗场。FOS和Tb由江苏易实生物科技有限公司提供。本试验以鱼粉和豆粕为蛋白源，鱼油和豆油为脂肪源，配制4 组等氮、等脂饵料。基础饵料组成及营养水平见表1。

表1 基础饵料组成及营养水平（风干基础） 单位：%

1.2 试验设计与饲养管理

正式试验前进行10 d 的驯养，驯养期间从商品饵料过渡至基础饵料，每天饱食投喂2 次（8：30、17：30）。驯养结束后选取300尾平均体重为（18.13±0.02） g的健康石斑鱼，随机分为4 组，每组3 个重复，每个重复25 尾鱼，置于75 cm×45 cm×50 cm 的玻璃水族缸进行56 d 养殖试验。T1 组（对照组）斜带石斑鱼饲喂基础饵料，T2 组、T3 组、T4 组在T1 组的基础上分别添加0.05% FOS+SE5+0.10% Tb、0.10% FOS+SE5+0.10% Tb和0.20% FOS+SE5+0.10% Tb。将原料粉碎，过60 目筛，按照配方比例采用逐级扩大法混匀。短小芽孢杆菌SE5添加量均为1×108CFU/g，均匀喷洒在已混匀的饵料原料中，使用双螺杆制粒机制成直径为2.5 mm的软颗粒饵料，在室温下风干12 h，分装于自封袋，置于4 ℃保存。

养殖用水为一级砂滤海水，试验期间水温保持在25～29 ℃，pH值约为8，盐度为24‰～30‰，连续24 h充气，每日换水量为养殖水体的50%。

1.3 样品采集

分别于试验第28、56 d对每个缸的鱼计数，称总重，统计各组鱼的生长性能、饵料利用率和存活率。

于试验第28、56 d分别从每个缸中随机捞取4尾鱼，用40 mg/L 丁香酚麻醉，血样取自尾静脉，于1.5 mL 离心管保存，在4 ℃恒温24 h离心（10 000 r/min、10 min）后收集血清。采集血液后，取出肠道，其中两尾鱼的肠道于-80 ℃冰箱保存，用于测定消化酶活性；另外2尾鱼的前肠（2 cm左右）置于Bouin氏液中固定超过12 h，用于制作肠道切片。

1.4 测定指标及方法

1.4.1 生长性能

2.确定资金计划管理的范围。根据资金的经营流程明确资金支出和收入的相关部门、团队。明确资金收入和支出类型。资金收入包括盈利收入、债务收入等，资金支出包括经济投资、友情投资等。企业将收入和支出情况作出详细的分化。

根据公式计算增重率（WGR）、特定生长率（SGR）、饵料系数（FCR）和存活率（SR）。

式中：W0为鱼的初重（g）；Wf为鱼末重（g）；FI为每尾鱼饵料摄入总量（g）；T为饲养天数（d）；N0为初始鱼尾数；Nf为最终鱼尾数。

1.4.2 血清免疫指标

采用南京建成生物工程研究所试剂盒测定血清超氧化物歧化酶（SOD）、溶菌酶（LZM）、酸性磷酸酶（ACP）和碱性磷酸酶（AKP）的活性。

1.4.3 肠道消化酶活性

肠道样品测定前经4 ℃冰箱解冻，使用滤纸吸干表面水分，剪取肠道组织约0.1 g，加入9 倍体积的灭菌生理盐水匀浆，4 ℃、3 000 r/min离心10 min，取上清液保存。采用福林酚法测定蛋白酶活性，采用分光光度计法测定淀粉酶（AMY）和脂肪酶（LPS）活性。

1.4.4 肠道形态观察

固定在Bouin 氏液中的前肠经一系列乙醇溶液脱水，使用二甲苯清除并嵌入石蜡中，切割为5 μm的切片，进行HE染色，使用Image-Pro Plus 6.0软件测量前肠绒毛高度、绒毛宽度、绒毛数量和肌层厚度。

1.5 数据统计与分析

采用SPSS 22.0 软件中的单因素方差分析和Duncan's多重比较法检验各组间差异，结果以“平均值±标准误”表示，P＜0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 复合添加剂对斜带石斑鱼长性能的影响（见表2）

表2 复合添加剂对斜带石斑鱼生长性能的影响

由表2 可知，不同日粮饲喂的斜带石斑鱼饵料系数差异不显著（P＞0.05）。试验28 d，与T1组相比，T2组、T3组、T4组斜带石斑鱼末重、增重率、特定生长率均有提高，其中T3组增幅最大（P＞0.05）。试验56 d，T2组、T3组、T4组斜带石斑鱼末重、增重率、特定生长率均显著高于T1组（P＜0.05），各组存活率均接近100%。

2.2 复合添加剂对斜带石斑鱼肠道消化酶活性的影响（见表3）

表3 复合添加剂对斜带石斑鱼肠道消化酶活性的影响

由表3 可知，试验28 d，与T1 组相比，T2 组、T3组、T4组斜带石斑鱼肠道蛋白酶和脂肪酶活性显著升高（P＜0.05）；淀粉酶活性随复合添加剂中果寡糖含量增加呈上升趋势，与T1组相比，T4组斜带石斑鱼淀粉酶活性显著升高（P＜0.05）。试验第56 d，与T1 组相比，T3 组、T4 组斜带石斑鱼蛋白酶和淀粉酶活性显著升高（P＜0.05），T4 组斜带石斑鱼的脂肪酶活性显著升高（P＜0.05）。

2.3 复合添加剂对斜带石斑鱼免疫指标的影响（见表4）

表4 复合添加剂对斜带石斑鱼免疫指标的影响

由表4 可知，试验28 d 时，与T1 组相比，T2 组、T3 组、T4 组斜带石斑鱼血清溶菌酶活性显著升高（P＜0.05）。

试验28、56 d 时，与T1 组相比，T2 组、T3 组、T4组斜带石斑鱼血清超氧化物歧化酶活性均有升高，其中T3组和T4组显著高于T1组（P＜0.05）；T3组斜带石斑鱼血清酸性磷酸酶活性最高，显著高于T1组（P＜0.05）。

2.4 复合添加剂对斜带石斑鱼肠道组织形态的影响（见图1～图3）

图1 复合添加剂对28 d时斜带石斑鱼肠道形态的影响（100×）

图2 复合添加剂对56 d时斜带石斑鱼肠道形态的影响（100×）

图3 复合添加剂对斜带石斑鱼肠道形态的影响

由图1和图2可知，各组石斑鱼肠黏膜形态结构都较为完整，绒毛排列整齐，与T1 组相比，T2 组、T3 组、T4组石斑鱼肠绒毛高度、绒毛宽度、肌层厚度和绒毛数量均有所增加。

由图3（a）可知，与对照组相比，T2 组、T3 组、T4 组石斑鱼肠绒毛高度显著增加（P＜0.05），T4 组显著高于T2 组和T3 组（P＜0.05）。试验28 d 时，T2 组、T3 组、T4 组石斑鱼肠绒毛宽度和肌层厚度显著高于T1 组（P＜0.05），T4 组肠绒毛宽度显著高于T3 组（P＜0.05）；T2 组和T3 组绒毛数量显著高于T1 组（P＜0.05）。试验56 d 时，T2 组～T4 组石斑鱼肠绒毛宽度和绒毛数量显著高于T1组（P＜0.05）；T2组和T4组肌层厚度显著高于T1组（P＜0.05）。

3 讨论

3.1 复合添加剂对斜带石斑鱼生长性能的影响

合生素由于结合了益生元和益生菌的积极作用，通常表现出更好的促生长作用[14]。研究表明，与单独添加益生菌或益生元相比，日粮中添加合生素可使锦鲤（Cyprinuscarpio）[15]、奥尼罗非鱼（Oreochromisniloticus♀×O.aureus♂）[16]、卵形鲳鲹（Trachinotusovatus）[17]、日本鳗鲡（Anguillajaponica）[18]表现出更高的WGR。此外，三丁酸Tb可维持菊黄东方鲀（Takifuguflavidus）肠道微生物平衡[19]，增强建鲤（Cyprinuscarpiovar）肠道抗氧化能力[20]，从而促进鱼生长。本研究中，复合添加剂（FOS+SE5+Tb）饲养斜带石斑鱼56 d，显著提高了斜带石斑鱼WGR和SGR，与Rodriguez-Estrada等[21]发现在饵料中添加甘露寡糖+粪肠球菌+聚羟基丁酸在虹鳟（Oncorhynchusmykiss）上的应用结果一致。

肠道的消化和吸收能力对鱼类生长具有重要作用[22]。消化酶活性尤其是蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶活性，与鱼类的消化能力密切相关。张春暖等[15]研究发现，锦鲤饵料中添加0.3% FOS和1×107CFU/g德式乳酸菌可提高锦鲤肠道蛋白酶和脂肪酶活性。李富东[23]发现，将FOS 和克劳氏芽孢杆菌联合添加到牙鲆（Paralichthysolivaceus）饵料中，牙鲆肠道蛋白酶和淀粉酶活性均有升高。Liu等[24]发现，凡纳滨对虾饵料中联合使用Tb 和FOS，其效果优于单独添加Tb。金子博[25]研究发现，三丁酸甘油酯和凝结芽孢杆菌在提升虎龙杂交斑（E.fuscoguttatus♀×E.lanceolatus♂）肠道脂肪酶活性上具有协同作用。本研究发现，试验28 d时，T2组、T3组、T4组斜带石斑鱼肠道蛋白酶和脂肪酶活性显著高于对照组，T4组肠道淀粉酶活性显著高于对照组，试验56 d，T3组和T4组肠道蛋白酶和淀粉酶活性显著高于对照组，表明复合添加剂（FOS+SE5+Tb）可提高斜带石斑鱼肠道消化酶活性，进而改善生长性能。

3.2 复合添加剂对斜带石斑鱼血清免疫功能的影响

Tb可通过增强机体免疫物质的活性和提高抗氧化能力增强机体免疫力[26]。Cheng等[27]研究发现，在饵料中添加Tb 可显著改善草鱼（Ctenopharyngodonidella）血清LZM 和SOD 活性。Liu 等[24]在高豆粕日粮中补充Tb，发现可显著改善凡纳滨对虾血淋巴ACP 和AKP 活性。研究表明，FOS 和芽孢杆菌均可以通过抑制病原微生物、增强免疫力及水生动物的疾病抵抗力[28-30]，并且FOS和芽孢杆菌具有协同作用，联合应用能够更好地提高三角鲂（Megalobramaterminalis）[30]、海参（Apostichopus japonicus）[31]和锦鲤[15]的免疫功能。本研究发现，斜带石斑鱼血清SOD、LZM活性显著升高，表明复合添加剂有效增强了机体的免疫功能。可能是因为FOS和Tb作为肠道微生态平衡的调节因子，能够促进肠道乳酸菌等有益菌的增殖[19,30]，而乳酸菌可以通过与病原菌竞争黏附位点增强宿主的免疫机能[32]。

3.3 复合添加剂对斜带石斑鱼肠道组织形态的影响

肠道既是营养物质消化和吸收的主要场所，也是抵御外部环境各种刺激的重要屏障[33-34]。研究表明，在饵料中补充Tb 能够修复黑鲷（Acanthopagrusschlegelii）[35]和黄姑鱼（Nibeaalbiflora）[36]高豆粕引起的肠道损伤，并维持肠道结构的完整性。与单独补充Tb 相比，Tb 和FOS 联合使用可进一步改善凡纳滨对虾肠绒毛高度[24]，Tb和甘露寡糖（MOS）联合添加可有效提高菊黄东方鲀前肠和后肠绒毛高度和宽度[19]。肖世玖等[37]研究发现，团头鲂饵料中补充合生素（地衣芽孢杆菌、纳豆芽孢杆菌和低聚木糖）能够显著提高绒毛高度。本研究发现，饵料中补充复合添加剂（FOS+SE5+Tb）可显著提高斜带石斑鱼肠绒毛高度、绒毛宽度、绒毛数量和肌层厚度，以T4组效果较好。

4 结论

复合添加剂（FOS+SE5+Tb）能够改善斜带石斑鱼的生长性能、免疫力以及肠道形态，且T4 组（0.2% FOS+1.0×108CFU/g SE5+0.1%Tb）效果较好。