张忠德顽咳方治疗肺气虚寒证咳嗽（慢性支气管炎）的网络药理学机制研究

何焯根，杨荣源（广东省中医院，广东 广州 510120）

慢性支气管炎是以咳嗽、咳痰为主要临床表现，连续2 年每年发作至少3 个月，并排除其他慢性咳嗽病因（如支气管扩张等）的一种慢性非特异性炎症性疾病，是临床上慢性咳嗽的常见原因[1]。支气管黏膜存在慢性非特异性的炎症、呼吸道杯状细胞过度产生和分泌黏液是其主要的病理变化[2]。现代医学对慢性支气管炎的病因并不清楚，大多数专家认为与有害气体、粉尘，如吸烟、灰尘、烟雾、空气污染等有关，呼吸道感染也会进一步加重慢性支气管炎的进展[3]。现代医学的治疗主要以祛除诱因、镇咳祛痰、抗感染等方式治疗，但疗效并不显著，大部分患者症状仍会反复发作，迁延不愈，不但严重影响生活质量，还可能进一步发展为慢性阻塞性肺疾病，甚至肺心病。

中医认为该病属“咳嗽”“久咳”“顽咳”范畴，多与肺气虚弱有关，并可能涉及脾肾，中医治疗该病具有一定的优势。广东省中医院张忠德教授是全国名中医、岐黄学者、享受国务院政府特殊津贴专家、全国老中医药专家学术经验继承工作指导老师、广东省名中医、岭南甄氏杂病流派第四代传人，师从岭南医学代表医家甄梦初、国医大师晁恩祥，中医临证30 余载，在中医辨治呼吸系统疾病方面积累了丰富的经验，尤其针对久咳、顽咳的中医辨治具有独到见解。他认为本病多为“肺虚气逆，兼夹顽痰”之证，以肺气虚寒证为主，因此治疗上以温肺散寒、化痰止咳为法，自拟顽咳方治疗慢性支气管炎患者，在临床上取得了很好的疗效。

网络药理学是为了解决中药复方因成分多、作用靶点复杂，传统药理学研究方法难以阐明作用机制的问题而出现的新兴研究方法。该方法通过构建“药物-成分-靶点”网络，运用网络拓扑学方法发现网络核心，能对中药复方复杂的作用机制进行整体研究。目前，顽咳方治疗慢性支气管炎的分子机制仍不清楚。本研究拟运用网络药理学技术，探讨张忠德教授自拟顽咳方治疗慢性支气管炎的药理机制。

1 材料与方法

1.1 顽咳方成分的获取与筛选顽咳方由化橘红、细辛、法半夏、前胡、紫菀、浙贝母、五味子共7 味中药组成。从中医药系统药理数据库和分析平台[4]（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP，https://www.tcmsp-e.com/）下载获取顽咳方化学成分。考虑中药主要依靠口服吸收入血成分发挥效用，因此根据化学成分的口服生物利用度（oral bioavailability，OB）和类药物指数（drug like index，DL），筛选OB ≥30%和DL ≥0.15 的成分进行下游研究。

1.2 慢性支气管炎疾病相关基因的获取慢性支气管炎疾病相关的基因通过比较毒物基因组学数据库（Comparative Toxicogenomics Database，CTD，http://ctdbase.org/）数据库和MalaCards 人类疾病数据库（https://www.malacards.org/）获取，有直接研究证据或者相关性分数≥50 的基因被定义为慢性支气管炎疾病相关基因。

1.3“药物-成分-共有靶点”网络的构建通过TCMSP 获取顽咳方中成分作用的人源性靶点，与慢性支气管炎疾病相关基因取交集获得共有靶点。筛选存在相互关系的药物、成分、共有靶点，使用Cytoscape 3.8.2 软件构建“药物-成分-共有靶点”网络并可视化。

1.4 GO 功能和KEGG 信号通路富集分析基因本位论（Gene Ontology，GO）和京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）信号通路富集分析使用WebGestalt 在线基因集分析工具（http://www.webgestalt.org/）进行。将共有靶点基因输入网站进行富集分析，使用Benjamini-Hochberg 法降低错误发现率（False discovery rate，FDR）校正P值。校正P值小于0.05 的GO 条目或信号通路被认为是显著富集，剔除与研究疾病完全无关的信号通路。

1.5 蛋白相互作用网络分析共有靶点输入STRING 11.5 在线数据库（https://string-db.org/）构建蛋白相互作用（Protein-protein interation，PPI）网络。两个靶点蛋白间的联合分数（combined score）大于0.9 被认为存在互作。PPI 网络的可视化和核心网络筛选均使用Cytoscape 3.8.2 进行。使用Cytoscape 软件中的分子复合检测（Molecular Complex Detection，MCODE）和cytoHubba 插件对共有靶点蛋白互作网络进行网络拓扑分析，以了解网络中的核心节点（靶点）。使用cytoHubba 插件计算最大团中心（Maximal Clique Centrality，MCC）值来衡量靶点在网络中的重要性，使用MCODE 插件的聚类算法输出网络中的核心子网络。

1.6 分子对接CB-Dock 2[5]（https://cadd.labshare.cn/cb-dock2）是基于Autodock Vina 内核的在线分子盲对接工具，可在对接位置不明确情况下进行小分子和靶点蛋白的分子对接，以明确两者的结合能力。靶点蛋白的三维结构从蛋白数据银行（Protein Data Bank，PDB，http://www.rcsb.org/）数据库获取，顽咳方成分的分子结构（mol2 格式）从TCMSP 下载。靶点蛋白与分子的结合能力用Vina 对接分数衡量。

2 结果

2.1 顽咳方成分与慢性支气管炎疾病相关基因的获取从TCMSP 数据库共获得顽咳方中化学成分605 个，根据OB 和DL 参数筛选及去重后共有中药成分94 个，其中化橘红11 个、细辛19 个、半夏16 个、前胡29 个、紫菀21 个、浙贝母7 个、五味子10 个，重复成分19 个。从CTD 和MalaCards 在线数据库上检索，共获得符合条件的慢性支气管炎疾病基因164 个。

2.2“药物-成分-共有靶点”网络构建结果从TCMSP 数据库得到顽咳方成分作用的人源化靶点291 个，与慢性支气管炎疾病基因取交集，共获得共有靶点81 个，详见图1。筛选存在相互关系的药物、成分、共有靶点共同构建“药物-成分-共有靶点”网络。构建结果显示该网络共有节点149 个，其中中药节点7 个，中药成分节点61 个，共有靶点节点81 个。网络共有边416 条，其中中药和中药成分的边78 条，中药成分和共有靶点间的边338 条，详见图2。

图1 顽咳方靶点与慢性支气管炎共有靶点的韦恩图Figure 1 Venn diagram of the shared targets of the Wanke Recipe and chronic bronchitis

图2 顽咳方治疗慢性支气管炎的“药物-成分-共有靶点”网络图Figure 2 “Drugs-components-shared targets” network diagram of the Wanke Recipe for the treatment of chronic bronchitis

2.3 GO 功能富集分析使用WebGestalt 在线工具，分别从生物过程（BP）、细胞组分（CC）和分子功能（MF）三方面对顽咳方作用靶点进行GO 富集分析，详见图3。在BP 方面，显著富集的GO 条目涉及细胞运动、氧代谢、脂多糖、皮质醇的代谢反应和调节等方面；富集的细胞组分主要为分泌颗粒腔体、细胞质囊泡腔体、囊泡腔和胞外基质等；在分子功能方面，与细胞因子的活性及受体结合、配体受体结合活性和血红素结合方面有显著相关性。

图3 顽咳方治疗慢性支气管炎靶点的GO 功能富集分析Figure 3 GO functional enrichment analysis of the targets of the Wanke Recipe for the treatment of chronic bronchitis

2.4 KEGG 信号通路富集分析使用WebGestalt 对顽咳方作用靶点进行KEGG 信号通路富集分析，结果显示这些靶点主要富集在免疫炎症相关的信号通路，如肿瘤坏死因子（TNF）、白细胞介素17（IL-17）、Th17 细胞分化、T 细胞受体等信号通路；与病原体识别和先天免疫应答有关的Toll 样和NOD 样受体信号通路；其他信号通路包括松弛素、细胞凋亡、缺氧诱导因子1（HIF-1）和C 型凝集素受体信号通路，详见图4。

图4 顽咳方治疗慢性支气管炎靶点KEGG 信号通路富集分析Figure 4 KEGG signaling pathway enrichment analysis of the targets of the Wanke Recipe for the treatment of chronic bronchitis

2.5 靶点蛋白相互作用网络分析使用STRING 和Cytoscape 构建靶点蛋白相互作用网络，详见图5-A。顽咳方成分共作用于81 个靶点，其中76 个靶点蛋白至少与1 个其他靶点存在相互作用，5 个靶点不与任何其他靶点发生相互作用。76 个靶点蛋白共存在354 个相互作用的边，蛋白相互作用网络富集P值＜1.0×10-16，意味着这些靶点蛋白间的相互作用比相同规模和分布的随机蛋白集合的相互作用更多，这些靶点可能具有更强的生物学联系。使用cytoHubba 软件计算MCC 以衡量靶点在互作网络中的重要性和中心度，排前10 位的靶点蛋白为：TNF、IL6、IL1B、IL1A、CCL2、JUN、RELA、CXCL8、IL4、IL10。使用MCODE 计算互作网络中的核心子网络，共获得子网络4 个。子网络1（图5-B）的靶点有IL4、IL10、CXCL10、IL1B、CCL2、IL6、CXCL8、MYC、IL1A、TNF、NFKBIA、CXCL2，主要属于炎症相关的白介素信号系统（主要为IL-17）和CXCL 趋化因子过程；子网络2（图5-C）中的靶点有EDN1、JUN、AKT1、PRKCB、GSK3B、NOS2、MAPK1、CREB1、TP53、RELA，主要属于松弛素信号通路和B 细胞受体信号通路过程；子网络3（图5-D）中的靶点有 IL2、MAPK8、MAPK14、MAPK3、FOS、TGFB1、NR3C1，主要属于T 细胞（Th1、Th2、Th17 等）分化和T 细胞受体途径。子网络4（图5-E）中的靶点有CCND1、CASP3、RUNX2、CYCS、CDKN1A、CASP8、CASP9、MCL1，主要属于p53 信号通路和细胞凋亡途径。

图5 顽咳方治疗慢性支气管炎靶点蛋白相互作用网络及核心子网络图Figure 5 Interaction networks and core sub-networks of the targeted protein-protein interaction（PPI）of the Wanke Recipe for the treatment of chronic bronchitis

2.6 核心靶点与顽咳方成分的分子对接选取MCODE 得分排前2 位的核心靶点TNF 和IL-6，与作用于这些靶点的顽咳方成分进行在线分子对接。结果显示，这些成分与核心靶点对接分数均≤-6.5，提示均能形成稳定的结合结构，详见表1 和图6。

表1 顽咳方治疗慢性支气管炎核心靶点与有效成分分子对接结果Table 1 Molecular docking results of core targets and active ingredients in the treatment of chronic bronchitis of the Wanke Recipe

图6 分子对接示意图Figure 6 Schematic diagram of molecular docking

3 讨论

慢性支气管炎是临床常见的一种慢性非特异性的炎症性疾病，现代医学对其确切机制尚不明晰，有害气体、粉尘，如吸烟、灰尘、烟雾、空气污染等是慢性支气管炎的常见外因，会诱发、加重慢性支气管炎的发生[3]。在分子机制层面，慢性支气管炎的发生与免疫、炎症关系最为密切。比如促炎基因TNF 的多态性会显著增加慢性支气管炎发病的风险[6]，暴露于香烟的慢性支气管炎气道的炎症因子IL-17 显著升高[7-8]，识别气道微生物并激活炎症反应的Toll 样受体和NOD 样受体在慢性支气管炎中也存在失调[9-13]。此外，慢性支气管炎多存在气道的纤维化。张忠德教授认为本病属于久咳、顽咳范畴，病机多为“肺虚气逆，兼夹顽痰”之证。肺气逆与气道炎症应激的表现颇为相似，顽痰属于有形之邪，易被外邪引动，具有慢性长期的特点，这与慢性支气管炎反复发作，易受外界粉尘、污染物诱发，气道存在纤维化等特点近似。

本研究结果显示，顽咳方治疗慢性支气管炎的机制是多途径、多靶点的。其中最为重要的是调控炎症和免疫相关通路。富集分析结果显示，顽咳方可以调控免疫细胞和炎症细胞因子相关的信号通路和功能，包括TNF 信号通路和细胞对TNF 反应的功能、Th17 和IL-17 信号通路、细胞因子活性和受体活性功能等。TNF 是一种多功能的促炎细胞因子，主要通过TNF 受体-1 和TNF 受体-2 两种受体发挥作用，对脂质代谢、凝血、胰岛素抵抗和内皮功能都有影响，同时也是反映炎症程度的生物标记物[14-15]。研究[6]表明，TNF 基因的多态性会显著增加慢性支气管炎发病的风险，TNF 在慢性支气管炎中可能加重了炎症反应，发挥了重要的病理作用。因此通过调控TNF 通路可能可以降低气道炎症，从而改善症状。Th17 是一类促炎的T 辅助细胞，分泌的细胞因子主要为IL-17，在维持黏膜屏障和促进黏膜表面病原体清除方面发挥重要作用[16]。IL-17 介导的反应可在上皮细胞、内皮细胞通过分泌TNF-α、CXCL1 和CXCL8 等应答IL-17 信号，促进中性粒细胞募集和炎症反应[17]。研究[7-8]表明，暴露于慢性支气管炎高危因素香烟会显著增高气道的IL-17 水平。而调控IL-17 可以抑制呼吸道的抗原呈递，部分抑制气道的免疫反应[18]。一些草药组合可通过调控IL-17/STAT3 信号通路抑制中性粒细胞性气道炎症[19]。顽咳方治疗靶点PPI 网络分析也表明，核心子网络1 和3 分别属于白介素信号系统（主要为IL-17）和T 细胞（Th1、Th2、Th17 等）分化和T 细胞受体途径。这些研究均表明，顽咳方可能通过调控Th17 免疫细胞和TNF、IL-17 等炎症细胞因子途径抑制支气管炎症，从而治疗慢性支气管炎。

顽咳方可能对松弛素信号通路具有调控作用。慢性支气管炎由于长期的慢性炎症普遍存在气道的纤维化[20-21]。而松弛素具有强大的抗纤维化作用。研究表明，松弛素能够通过基质金属蛋白酶分解胶原蛋白的激活剂刺激胶原蛋白降解，抑制胶原蛋白在气道中的积累[22]。此外，松弛素可抑制气道肥大细胞分泌和血小板活化，这是慢性咳嗽和气道高反应的重要机制之一[23]。松弛素在慢性支气管炎发病和治疗中的作用尚未十分清晰，而本研究结果显示顽咳方作用靶点显著富集于松弛素信号通路，靶点PPI 网络中的核心子网络2 主要属于松弛素信号通路，提示了松弛素通路在慢性支气管炎治疗中的作用。顽咳方是如何通过松弛素信号通路治疗慢性支气管炎的机制需要更深入的研究。

顽咳方对Toll 样受体和NOD 样受体信号通路具有调控作用。Toll 样受体和NOD 样受体均与病原体的识别和先天免疫应答有关。与气道黏膜屏障接触的微生物会被这两种受体识别，从而激活免疫细胞反应。这两种受体介导的途径均与慢性和特发性的炎症性疾病密切相关[24]。比如TLR2 受体在灰尘所致的慢性支气管炎气道中高表达[9]。TLR2 和TL4 受体在儿童慢性支气管炎中显著升高，并介导了中性粒细胞气道炎症[10]。TLR4 在气道炎症和黏液高分泌中起重要作用，通过干预该通路可抑制慢性支气管炎气道炎症和黏液高分泌[11-12]。而NOD 样受体则介导了嗜酸性粒细胞与支气管上皮细胞相互作用的激活[13]。我们的研究显示，顽咳方可能通过调控Toll 样受体和NOD 样受体通路发挥治疗慢性支气管炎的作用。

此外，顽咳方还可以调控凋亡、p53、HIF-1 和C 型凝集素受体等信号通路，但这些通路在慢性支气管炎中的作用尚不十分清楚，这些机制是否参与了慢性支气管炎的发生发展，以及顽咳方是否通过调控这些通路对慢性支气管炎发挥治疗作用，需要在未来开展深入的机制研究。

对共有靶点构建蛋白互作网络，运用网络拓扑算法进行网络核心计算，发现网络中最核心的2 个靶点为TNF 和IL-6，均属于炎症相关的细胞因子。TNF 的作用已进行了讨论，而IL-6 可促进幼稚CD4+T 细胞的特异性分化，从而在先天免疫反应与获得性免疫反应的联系中发挥重要作用，与TNF 信号通路、Th17/IL-17 信号通路存在相互作用[25]。通过MCODE 计算发现4 个核心子网络。子网络1 与炎症细胞因子（主要为IL-17）和CXCL 趋化因子过程有关；子网络2 主要与松弛素信号通路有关；子网络3属于T 细胞（Th1、Th2、Th17 等）分化和T 细胞受体途径；子网络4 主要属于p53 信号通路和细胞凋亡途径。这与富集分析中共有靶点主要富集在炎症和免疫途径、松弛素信号通路结果基本一致，并进一步缩小了范围，明确了其中的核心靶点。

分子对接实验和一些相似中药的实验研究进一步明确或佐证了顽咳方对核心靶点的调控作用。分子对接结果显示，顽咳方成分能与核心靶点TNF、IL-6 形成稳定的复合结构，明确了顽咳方对核心靶点的作用。此外，一些相似中药复方的实验研究也佐证了本研究的结果。董娅慧等[26]的研究显示，同样含中药紫菀和有效成分木犀草素、懈皮素的中药复方止嗽散可显著降低慢性支气管炎大鼠血清IL-6 和TNF-α 含量，下调肺组织缺氧相关蛋白HIF-1α；应丹萍等[27]应用含半夏、紫菀的自拟方可降低临床慢性支气管炎患者血清IL-6 和TNF-α 水平；含有半夏的中药复方可以降低CD4+IL-17+T 细胞（Th17）含量治疗慢性支气管炎[28]。这些实验研究间接证实了含有与顽咳方相似成分的中药复方可能通过调控核心靶点IL-6、TNF 和关键通路IL-17/Th17 发挥治疗作用，但其他分子机制仍需要在未来开展更多的机制研究。

综上所述，张忠德教授自拟经验方顽咳方对慢性支气管炎的药理机制是多靶点、多通路的复杂过程，其机制可能主要通过调节TNF、Th17/IL-17 等炎症和免疫相关通路、松弛素、Toll 样和NOD 样受体信号通路发挥治疗作用。基于网络药理学研究结果，可进一步开展多靶点、多通路的药理学验证，为深入阐明名中医有效经验方的作用机制提供新思路。