超高效液相串联质谱法测定牛奶中8 种氟喹诺酮类兽药残留

张瑞婷

（北京市产品质量监督检验研究院，北京 101300）

氟喹诺酮类药物为白色或淡黄色晶型粉末，属于广谱抗生素，常被用于预防和治疗奶牛疾病[1]。兽药的过量使用或不当使用与公众的健康息息相关，长期、低水平的接触方式不仅导致细菌产生耐药性，还会产生各种慢性、蓄积性毒害，给消费者带来潜在危险。因此，建立兽药残留的分析方法对于风险监控是十分必要的[2]。目前，兽药残留量的检测方法主要有金标检测法、酶联免疫吸附法、高效液相色谱法、气相色谱法和质谱法等[3]。超高效液相串联质谱法的优点是选择性强、应用范围广、分离效果好、灵敏度高和能自动化操作[4]。其可以把待测组分分离与结构的定量分析有机结合在一起，特别适用于药物残留量和药物的确证分析[5]。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

超高效液相串联质谱仪（Waters 公司）；氮吹浓缩仪（Organomatian Associates 公司）；冷冻离心机（Sigma 公司）；Oasis HLB 固相萃取柱（200 mg，6 mL，Waters 公司）。

8 种喹诺酮类兽药标品：恩诺沙星、诺氟沙星、环丙沙星、司帕沙星、氧氟沙星、奥比沙星、萘啶酸和噁喹酸，均购于德国DR 公司；乙腈、甲醇、正己烷和甲酸（HPLC 级）；超纯水（Mili-Q 公司）。

1.2 溶液的配制

1.2.1 标准储备溶液

精密称量各种药品标准品10 mg（精确到0.1 mg）于10 mL 容量瓶（棕色）中，用乙腈超声溶解并定容至刻度（其中噁喹酸需加少量NaOH 溶液溶解），配制成1.0 mg·mL-1标准储备溶液，4 ℃冰箱避光保存。

1.2.2 混标工作溶液

取洗净烘干的50 mL 棕色容量瓶，加入500 μL储备液，乙腈定容至刻度，配制成浓度为10.0 μg·mL-1的混标中间溶液，置于4 ℃冰箱冷藏避光保存。

1.2.3 流动相

0.3 %甲酸水溶液：准确吸取3 mL甲酸至1 000 mL容量瓶，用超纯水定容至刻度，现配现用。流动相：乙腈∶0.3%甲酸=10 ∶90。

1.3 样品前处理

1.3.1 提取

将牛奶样品轻晃混匀后称取5.00 g（精确到0.01 g），装入50 mL 的PP 管中，依次加入无水硫酸钠5 g，1%的甲酸-乙腈溶液20 mL，轻柔涡旋混匀，充分反应。超声波提取时，保持处于冰浴环境中，离心转速5 000 r·min-1，时间5 min，之后取上清液于另一洁净的离心管中。将剩余残渣重复一次上述操作，取上清液。吸取10 mL 提取到的上清液，加入20 mL 乙腈饱和的正己烷，振荡静置分层弃去正己烷层，氮气吹至近干。

1.3.2 净化

HLB 固相萃取柱（200 mg，6 mL）使用前用6 mL甲醇洗涤、6 mL 水净化，将提取的上清液以2 ～3 mL·min-1的速度过柱，过两次后弃去滤液，用2 mL 5%的甲醇溶液淋洗，弃去淋洗液，减压真空泵抽取5 min，在吸附柱中加入5 mL 甲醇洗脱液，5 000 r·min-1离心1 min，将收集到的洗脱液在氮气下吹至近干后，加入1 mL流动相溶液溶解，经0.22 μm微孔滤膜过滤，以备上机分析测定使用。

1.4 测定条件

1.4.1 色谱条件

色谱柱：Acquity UPLC C18色谱柱（2.1 mm×50 mm，1.7 µm BEH 颗粒，美国沃特世公司）；流动相：A 相为乙腈，B 相为0.3% 甲酸水溶液；流速：0.3 mL·min-1；柱温：30 ℃；进样体积：5 μL。

1.4.2 质谱条件

离子源：电喷雾电离-正离子模式（ESI+）；检测方式：MRM（多反应监测）；毛细管电压：3.5 kV；脱溶剂气流量：800 L·h-1；锥孔气流量：120 L·h-1；碰撞气：氩气；碰撞气压：0.18 Pa。

2 结果与分析

2.1 提取剂的选择

在酸性提取溶剂中，氟喹诺酮类药物更容易被萃取；乙腈属于极性溶剂，可避免从样品中提取过多的脂肪，同时具有很好的蛋白沉积效果，可沉积样品中99%的蛋白，避免其他杂质的干扰。因此，初步确定采用乙腈为提取溶剂。

本实验对纯乙腈、1%乙酸-乙腈、1%甲酸-乙腈3 种提取剂提取效果进行了对比，结果显示酸化乙腈提取效果更佳。其中1%甲酸-乙腈、1%乙酸-乙腈的提取效果相差不大，但1%甲酸-乙腈提取后的色谱峰更加尖锐，故确定最终提取溶剂为1%甲酸-乙腈。

2.2 流动相的选择及质谱条件的优化

以不同比例的乙腈-水为流动相进行梯度洗脱时，为了提高正离子化效率并改善峰形，同时考虑到分析组分中大多含有氨基和羧基基团，所以分别尝试了在水相中加入0.1%甲酸、0.2%甲酸、0.3%甲酸、5 mmol·L-1甲酸铵、10 mmol·L-1甲酸铵进行洗脱。对比结果显示，流动相中加入0.3%甲酸时，样品由结合态变为游离态，灵敏度高，分离效果好。

质谱参数的优化是通过ESI 探针分别将8 种兽药（浓度1 mg·L-1）的混合标准品工作液在正电离模式下用质谱蠕动泵自动进样，对每一种兽药进行母离子全扫描确定各种待测兽药的分子离子，而后取其分子离子为母离子，对其进行全扫描。选取丰度最强、干扰最小的两个离子用于目标分子的定量和定性分析，表1 为8 种兽药质谱分析优化参数。

表1 8 种兽药质谱分析优化参数

2.3 线性范围及检出限

将8 种待测兽药配制成一系列标准工作溶液，绘制标准工作曲线，对目标物质进行定量分析。分别得到待测兽药的标准曲线回归方程、定量限及相关系数，结果表明在0.5 ～500.0 μg·mL-1，R2＞0.996，8 种兽药的回归方程均线性良好。通过逐级稀释，根据信噪比（S/N）等于10 确定为定量下限，结果见表2。

表2 8 种兽药的线性方程、相关系数

2.4 回收率与精密度

在待测样品中添加8 种兽药的混标工作溶液，分别在10 μg·kg-1、50 μg·kg-1、100 μg·kg-13 个浓度水平下进行回收率实验，同时每个浓度水平下进行6次平行实验，计算精密度。结果见表3。结果显示，该方法的平均回收率为81.3%～98.8%，RSD 为2.3%～9.8%，表明本方法的回收率和RSD 均在标准范围内，符合多残留分析的要求。

表3 牛奶中8 种兽药的回收率与精密度

2.5 实际样品检测

在市场上随机购买15 份不同批次牛奶样品，经检测发现1 份阳性样品。恩诺沙星检出值12.1 µg·kg-1，其他药物无检出。该例阳性样品兽药残留量未超过GB 31650—2019 规定的最高残留限量，可认为是合格样品。

3 结论

本实验建立了一种简单、灵敏、快速的8 种兽药残留分析方法，通过对净化方法、流动相、质谱条件等一系列实验条件的探索优化，建立了UPLCMS/MS 同时检测牛奶中8 种氟喹诺酮类兽药的分析方法。该方法克服了检测种类少、检测时间长、实验成本高等问题，适用于牛奶样品多残留的快速筛查和检测。