北京地区野生鼠类及其携带蜱媒病原体调查

刘立明,汤 芳,刘 斌,付婷婷,4,范君文,白新鸽,赵翠青,白杰英,7*

(1.吉林农业科技学院 动物科技学院,吉林 吉林市 132101;2.武警特色医学中心研究部 突发公共卫生事件医学防治研究所,北京 102613;3.吉林省金泰美迪生物技术有限公司,吉林 长春 130122;4.中国科学院 理化技术研究所 抗菌材料检测中心,北京 100190;5.北京市动物疾病预防控制中心,北京 100020;6.青岛科技大学 高分子科学与工程学院,山东 青岛 266042;7.北京大学 国家生物医学成像科学中心,北京 100871)

野生鼠类是生态系统中重要的一员,也是易于被蜱寄生的动物宿主,其在城市、森林、草原、荒漠等多种生境中均有分布,本身可通过直接或间接途径传播鼠疫、肾综合征出血热、钩端螺旋体病等多种自然疫源性疾病[1],亦可携带包括巴贝西虫、螺旋体、斑点热群立克次体、无形体在内的多种蜱媒病原体。有研究报道在黑线姬鼠和东方田鼠中发现巴贝西虫[2];靳木子等[3]和乌兰图雅等[4]在毛足鼠、长爪沙鼠、黑线仓鼠、长耳跳鼠、五趾跳鼠和达乌尔黄鼠中均发现伯氏疏螺旋体;ZHAN等[5]和CAO等[6]在黑线姬鼠、日本田鼠、长尾姬鼠等多种鼠类中发现立克次体和无形体。鼠作为蜱的寄生宿主,之所以能够成为蜱媒疾病病原体的储存宿主,主要取决于其生态与生理学特征[7],如宿主分布特点、种群优势、数量相对稳定以及对病原体的高感受性、低敏感性,带病毒率相对稳定,并能通过多种途径排出病原体等因素;其次,其种群数量、带病毒率的季节和年度波动与人类疫情流行强度基本吻合[8],大大提高了蜱传疾病的感染风险。

近年来,一些新发现的蜱媒疾病,如人巴贝西虫病、莱姆病、斑点热、无形体病等在我国及周边国家和地区不断涌现,且发病区域和发病率不断扩大和上升,对人类的健康和国民经济建设造成很大危害,已受到世界各国的普遍关注和重视[9]。北京地区作为我国首都和重要的旅游城市,地形地貌复杂,生态环境类型多样,动植物区系丰富,人口流动复杂,为媒介蜱和宿主动物的繁衍生息以及为蜱传疾病的发生和持续存在提供了必要条件。最近,我国学者又在蜱中陆续发现多种新发蜱传病原体,如新疆地区的马赛立克次体(R.massiliae),暂定巴布瑞立克次体(C.R.barbariae)[10];北京地区的一种新无形体——北京无形体[11]。随着全球气候变暖,自然灾害的发生,气候和生态环境的不断改变,大规模国防和经济建设,畜牧业和旅游业的快速发展以及贸易的不断流通,全球一体化进程的加快导致蜱和宿主动物的种类、密度、分布和生活环境可能发生变化[12]。人类进入蜱媒疾病疫源地和接触野外蜱和宿主动物的机会大大增加,打破了病原体-媒介-宿主的固态平衡,致使原有地区的蜱媒疾病的发生范围会扩大、发生频率和强度会增加,一些新的蜱媒疾病也会不断出现,更加剧了蜱媒传染病的暴发和流行,使得蜱媒传染病不断发生,给人类健康和社会经济造成影响,其预防控制变得更加复杂。旧发蜱传病原体的暴发和新发蜱传病原体的不断出现,给科研人员和防疫人员带来了巨大挑战。

本研究共选取北京市十渡、云蒙山和东灵山3个地区为采样点,于2018-2019年间对该地区采集的鼠类动物样本进行多种病原体分子生物学检测,并选取有代表性阳性样本进行测序和核苷酸序列分析,基于目的基因序列构建系统发育树,确定病原体的分类学位置。为进一步研究北京地区宿主动物和媒介蜱中蜱媒病原体的种类和分布提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 鼠样本的采集根据本研究需要,于2018-2019年间在北京市部分景点中采集鼠种开展流行病学调查,包括北京市门头沟区东灵山、密云区云蒙山、房山区十渡共3个调查点采集鼠种。采用夹夜法和诱捕法捕获鼠,并现场鉴定种类。经消毒处理后,解剖取其脾脏,-20℃短期保存备用,长期保存于-80℃。

1.2 主要试剂与仪器AllPrep DNA/RNA Mini Kit DNA/RNA提取试剂盒购自Qiagen公司;DreamTaq Green PCR Master Mix (2×)购自Thermo Fisher Scientific公司;DL2000 DNA Marker和去离子水购自TaKaRa公司;溴化乙锭(EB)和无水乙醇购自国药集团化学试剂有限公司;本研究所用PCR引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。台式高速离心机购自Eppendorf公司;VeritiTM96-Well Thermal Cycler购自Applied Biosystems公司;DYY-8C稳压稳流电泳仪购自北京六一仪器厂;Bio-Rad Gel Doc XR+凝胶成像系统购自Bio-Rad公司;海尔MZC-2070M1微波炉购自海尔公司;HH-S-4恒温水浴箱购自Amersham公司;Tissuelyser-24L组织研磨仪购自上海净信科技;A2型生物安全柜购自美国Thermo公司。

1.3 试验方法

1.3.1样本处理及核酸提取 无菌条件下剖解小鼠,采取鼠脾脏标本,从鼠脾脏标本中提取脾脏及感染病原体总的基因组,将鼠的脾组织剪碎至20～30 mg的碎块放入2 mL的EP管中,加入洁净钢珠2～3颗、500～800 μL无菌PBS,使用组织研磨仪研磨至匀浆,使用AllPrep DNA/RNA Mini试剂盒提取核酸。

1.3.2蜱媒病原体基因PCR扩增检测 分别以巴贝西虫18S rRNA、伯氏疏螺旋体16S rRNA、斑点热群立克次体ompA、无形体16S rRNA特异性引物(表1),采用巢式PCR方法扩增目的片段,反应体系25 μL:DreamTaq Green PCR Master Mix(2×)12.5 μL,上、下游引物各0.5 μL,Nuclease-free water 9.5 μL,DNA模板2 μL。反应条件见表2,进行2轮PCR反应。PCR反应完成后,取第2轮扩增产物4 μL进行琼脂糖凝胶电泳,用凝胶成像仪观察并记录结果。

表1 蜱媒病原体检测所用引物序列及相关信息

表2 蜱媒病原体检测PCR反应条件

1.3.3PCR产物测序及核苷酸序列分析 将PCR扩增的阳性样本送往生工生物工程(上海)股份有限公司进行纯化并完成序列测定。将测出阳性标本的基因序列使用DNAstar软件拼接后登陆到NCBI,将拼接后的序列与GenBank中注册的核苷酸序列进行BLAST最大同源性比对分析,确认是否为感染蜱媒病原微生物的目的基因,并用MEGA 7.0软件做系统发育树分析,采用基于maximum composite-likelihood模型的Neighbor-Joining法构建遗传进化树。通过1 000次重复算法获取稳定的遗传进化树,确定其分类学位置。

1.4 统计学分析采用SPSS 19.0统计软件进行统计学分析,采用Fisher确切概率法来比较不同地区和鼠种的蜱媒病原体的感染率。P<0.05,差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 宿主动物与媒介调查结果分析

表3 北京部分地区野鼠的种类及分布 只

表4 北京地区不同种类鼠中感染情况 只

北京地区的3个调查点感染情况见表5,发现东灵山存在巴贝西虫、伯氏疏螺旋体和无形体感染,感染率分别为10.40%(31/298)、2.01%(6/298)和6.47%(18/298);云蒙山地区存在巴贝西虫、伯氏疏螺旋体、斑点热群立克次体和无形体感染,感染率分别为21.11%(19/90),4.44%(4/90),1.11%(1/90)和10.00%(9/90);十渡存在巴贝西虫和无形体感染,感染率分别为12.22%(11/90)和5.56%(5/90)。各调查点间比较,3个调查点在巴贝西虫检测中存在统计学意义(P=0.035)。

表5 北京地区不同调查点感染情况 只

表6 不同鼠种复合感染检测情况 只

2.2 部分病原体核苷酸序列的测定与分析

图1 巴贝西虫18S rRNA基因同源性分析

图2 伯氏疏螺旋体16S rRNA基因同源性分析

图4 无形体16S rRNA基因同源性分析

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