超分辨率成像研究尿石素不同亚型对线粒体形态亚群差异分布的影响

孟 鹏，吴忠玉

（1. 山东第一医科大学（山东省医学科学院）药物研究所，山东 济南 250117；2. 济南良福精合医药科技有限公司，山东 济南 250117）

尿石素（urolithin）是天然多酚类化合物，是食物中的鞣花单宁被肠道菌群代谢产生的一种次生代谢产物[1]。研究表明，尿石素具有抗氧化、抗炎、抗癌、诱导线粒体自噬等多种生物活性[2-5]。尿石素A（urolithin-A，UA）、尿石素B（urolithin-B，UB）、尿石素C（urolithin-C，UC）是目前研究最广泛的尿石素的异构体。

传统的食品和药品毒性测定方法，如cell counting kit-8（CCK-8）、噻唑蓝法（MTT）、酶联免疫吸附测定法（ELISA）等，可在多细胞水平上评估药物的毒性，却无法在亚细胞水平上实现药物毒性的准确评估和分析[6-9]。CCK-8试剂中的主要成分是2-（2-甲氧基-4-硝基苯基）-3-（4-硝基苯基）-5-（2,4-二磺酸苯）-2H-四唑单钠盐（WST-8），它被细胞线粒体中的脱氢酶氧化为具有高度水溶性的黄色甲臜产物。CCK-8的细胞毒性检测中生成的甲臜物的数量与活细胞的数量成正比，因此CCK-8可在多细胞水平进行毒性检测。以荧光显微成像技术为原理的结构光照明显微镜（structure illumination microscopy，SIM），利用结构光突破衍射极限，然后通过结构光的旋转移动和算法识别，实现了线粒体的超分辨成像[10]。此外，SIM还具有光毒性低、成像速度快、荧光探针要求低和样品制备简单等优点[11-12]。细胞遇到有毒物质时，线粒体中球状线粒体的比例增加，可以此作为判断药物毒性大小的依据[13]。因此可利用SIM对线粒体结构的超分辨成像，评估尿石素亚细胞水平的毒性差异（见图1）。

图1 CCK-8和SIM毒性检测原理对比

本文通过SIM于亚细胞水平研究3种尿石素亚型UA、UB和UC对HeLa细胞中线粒体的影响，并采用线粒体长宽比的数据分析方法探究3种亚型在亚细胞水平的毒性，建立药物毒性亚细胞水平毒性研究方法；并将SIM毒性检测方法与经典的细胞毒性检测方法CCK-8对比，评价UA、UB和UC在多细胞层面和亚细胞层面的细胞毒性差异。

1 材料与仪器

1.1 仪器

数显三用恒温水箱（山东欧莱博）；TDZ5-WS医用离心机（湖南湘仪）；QP-160二氧化碳培养箱（济南鑫贝西）；BSC-1500IIA2-X生物安全柜（济南鑫贝西）；XD-202倒置生物显微镜（南京江南永新光学）；F-320荧光分光光度计（天津港东科技）；LDZF-50L-II立式高压蒸汽灭菌器（上海申安）；UV-2600紫外可见分光光度计（日本岛津）；SIM显微镜（Delta Vision，USA）。

1.2 药品与试剂

尿石素A（1143-70-0），尿石素B（1139-83-9），尿石素C（165393-06-6）（麦克林）；胎牛血清和MTG（Mito-Tracker Green）（赛默飞）；CCK-8（Med Chem Express）；PBS和DMEM（Dulbecco’s Modification of Eagle’s Medium）（上海达特希尔和）；Penicillin-streptomycin（10000 U/ml，Gibco）。

2 方法

2.1 细胞培养

HeLa细胞取自刘飞实验室（山东省药学科学院）。HeLa细胞于DMEM培养基（添加10 % FBS、1 %青霉素和链霉素）中培养，并置入37 ℃，5 %二氧化碳培养箱。

2.2 细胞毒性检测

用培养基稀释的HeLa细胞以8×103个/孔的密度接种至96孔板，并于37 ℃含5 % CO2的培养箱中培养24 h。然后使用含0，1.0，5.0，10.0，20.0，40.0 μmol/L尿石素的DMEM溶液代替96孔板中的原始培养基。培养12 h后，向每个孔中加入10 μl CCK-8溶液，并在培养箱中孵育2 h。最后，通过酶联免疫吸附试验测定450 nm处的吸光度。

2.3 药物孵育

将UA、UB、UC用无色DMEM分别配制为最终浓度为10 μmol/L和40 μmol/L溶液，置于37 ℃水浴预热10 min。然后分别将细胞与各个浓度细胞亚型的溶液孵育12 h，用预热的DMEM洗涤7次，然后进行活细胞标记。

2.4 活细胞标记

线粒体的标记采用线粒体商业探针MTG。具体操作：将MTG用无色DMEM配制为最终浓度为100 nmol/L溶液，置于37 ℃的水浴锅中预热10 min。然后，将细胞与100 nmol/L MTG孵育30 min后，用预热的DMEM洗涤7次，最后更换预热的无色DMEM用于超分辨显微镜成像。

2.5 SIM显微镜成像

HeLa细胞以1×105个/ml的密度接种于35 mm玻璃底培养皿，并与2 ml 含10 % FBS的DMEM一起孵育24 h（5 % CO2，37 ℃）。经过药物孵育12 h和活细胞标记后在配备100×/1.42数值孔径油浸物镜和固态激光器下成像。MTG在488 nm处激发并于500～550 nm处发射。

2.6 数据分析

使用GraphPad Prism 8和Image J进行统计分析。对数据进行正态性检验；在正态分布情况下，结果统计比较用t检验；在非正态分布情况下，结果统计比较用Mean-Whitney检验。显著性水平设置为P＜0.05具有统计学差异，数据表示为平均值±平均值的标准误差（±s）。线粒体的长宽比分析中，按照线粒体长宽比的大小将棒状和颗粒状的线粒体分成1≤长/宽＜1.5（圆状线粒体），1.5≤长/宽＜2（中间状线粒体），2≤长/宽＜5（管状线粒体），5≤长/宽（纤维状线粒体）4类进行分析（见图2）。

图2 线粒体长宽比分析

3 结果

3.1 CCK-8对尿石素3种亚型的细胞毒性分析

使用CCK-8分别检测UA、UB、UC（1～40.0 μmol/L）孵育HeLa细胞12 h后的细胞毒性（见图3）。药物浓度为10.0 μmol/L时，和对照组相比3组均无明显的细胞毒性。表明3种药物的毒性微弱，CCK-8无法检测出尿石素3种亚型10.0 μmol/L浓度以下的毒性。药物浓度为20 μmol/L时，与对照组相比，只有UC能检测到明显的药物毒性，表明UC毒性最强。药物浓度为40.0 μmol/L时，与对照组相比，3种药物均表现显著的细胞毒性。

图3 3种尿石素亚型的细胞毒性检测

3.2 SIM显微镜对尿石素3种亚型的分析

3.2.1 线粒体的SIM成像 为了避免药物自发荧光对SIM成像的影响，使用荧光分光光度计分析3种药物10.0 μmol/L时的荧光强度，结果表明，488 nm波长激发下无显著的荧光（见图4），因此选用商业线粒体探针MTG，用于活细胞线粒体成像（MTG在488 nm下发绿色荧光）。

图4 3种尿石素亚型激发光下的荧光光谱（488 nm）

将未经药物处理的HeLa细胞用MTG进行活细胞标记后，用SIM进行成像（见图5）。由图5可见，在超高分辨率SIM显微镜下，可清晰地观测到未进行药物处理的细胞中的丝状的棒状线粒体，并能看到线粒体的单个形态和线粒体嵴的构造。使用图像处理软件Image J分析未经药物处理的HeLa细胞线粒体的长/宽数据，正常的HeLa细胞中管状的线粒体占比最大，纤维状的线粒体占比最小。

图6 浓度10.0 μmol/L和40.0 μmol/L的3种尿石素亚型的线粒体SIM成像和长宽比分析

3.2.2 药物处理的细胞线粒体的形态分析 根据3.1项结果，药物浓度10.0 μmol/L是3种亚型均检测不到细胞毒的最大浓度，40.0 μmol/L是3种亚型均能检测到显著细胞毒的最小浓度。因此将10.0 μmol/L和40.0 μmol/L作为SIM成像的浓度，与SIM毒性检测对比。分别使用浓度为10.0 μmol/L和40.0 μmol/L的UA、UB、UC孵育HeLa细胞12 h，MTG标记活细胞之后，使用SIM成像并统计分析线粒体长宽比（见图5）。

由图5可见，药物浓度为10.0 μmol/L时，3个加药组均球状线粒体增加和管状的线粒体减少，与对照组相比呈显著性，表明线粒体形态损伤，检测到3种尿石素亚型的毒性。药物浓度为40.0 μmol/L时，3个加药组也球状线粒体增加和管状的线粒体减少，与对照组相比呈显著性；UC组的球状线粒体比例最大，管状线粒体比例最小，这表明相同浓度的3种药物亚型中UC在亚细胞水平毒性最强，与CCK-8的结果一致。结果表明，SIM在亚细胞水平的细胞毒性检测方法能在更低的药物浓度检测到药物毒性，这对尿石素在食品药品领域的应用和作用机制研究具有指导意义。

4 结论

通过CCK-8多细胞水平和SIM亚细胞水平的细胞毒性检测方法，评估了尿石素3种亚型的细胞毒性。3种尿石素亚型对HeLa细胞均有轻微的细胞毒性影响，且UC的细胞毒性在3种亚型中最强，为后续的尿石素的相关研究提供了参考。CCK-8和SIM超分辨成像方法对比表明，SIM亚细胞水平的细胞毒性检测能在更低的药物浓度时检测到毒性。SIM为食品和药品亚细胞水平的毒性评估提供了新方法。

本文基于超分辨成像技术，开发了新的药物评估方法，用于精准分析药物亚型的活性差异和潜在细胞毒性。与传统细胞毒性测定方法相比，超分辨成像方法可在亚细胞水平上实现药物精准评估。该方法可用于食品与药品亚细胞水平的毒性检测。