基于特征图谱及苯乙酮类成分含量测定的白首乌种属差异研究

林美玉，陈文华，徐凌川，韩 婷，苏 娟，张 弛 （.海军军医大学药学系, 上海 00433；.山东中医药大学药学院, 山东 济南 50355）

白首乌为萝藦科（Asclepiadaceae）鹅绒藤属（Cynanchum）植物泰山白首乌（戟叶牛皮消）C.bungeiDecne.、隔山消（隔山牛皮消）C.wilfordii（Maxim.）Hemsl.及滨海白首乌（耳叶牛皮消）C.auriculatumRoyle ex Wight.的块根[1-2]，其主要生物活性成分为苯乙酮和C21-甾体皂苷类，具有抗肿瘤、抗炎、舒张心血管，保肝、降糖和神经保护等作用[3-13]。泰山白首乌块根作为正品传统中药白首乌曾收录于1977 年版《中国药典》，为泰山四大名药之首，是山东道地药材[14]。2002 年版《中国中药志》记载，白首乌还包含滨海白首乌C.auriculatum和隔山消C.wilfordii。滨海白首乌在2015 年被国家卫计委批准为普通食品，隔山消于2008 年被《韩国药典》收载[1-2]。

随着对白首乌生物活性研究的不断深入，其药用价值不断体现，市场需求也逐年攀升，但是白首乌药材市场存在以下问题：白首乌正品（泰山白首乌）为野生型、两年生，产量低，人工栽培极其困难，市场供应不足，因此有人将滨海白首乌和隔山消都作为白首乌正品销售，存在白首乌品种混淆的现象[15]。泰山白首乌与其近缘种滨海白首乌和隔山消的品质是否有差异，两种近缘种当作白首乌药材应用是否合理，针对这些问题，本研究收集25 批白首乌类药材，建立不同产地白首乌的HPLC 指纹图谱，运用HPLC 指纹图谱进行质量评价。同时对不同批次的白首乌中4 种苯乙酮类成分进行含量测定，结构式见图1，从而为不同品种白首乌药材的品质评价提供理论依据。

图1 白首乌中4 种苯乙酮类成分结构式

1 实验部分

1.1 仪器和试剂

LC-20AD 高效液相色谱仪（岛津，四元梯度系统）；色谱柱Diamonsil C18柱(4.6 mm× 250 mm,5 μm)；AG285 型电子分析天平（瑞士Mettler-Toledo公司）。

4-羟基苯乙酮（CAS：99-93-4，纯度≥98%）、2',4'-二羟基苯乙酮（CAS：89-84-9，纯度≥98%）、2',5'-二羟基苯乙酮（CAS490-78-8，纯度≥98%）均为国药集团提供，白首乌二苯酮为实验室自制（纯度≥98%）。

白首乌药材样品均于2018 年采集或购买自国内不同地区（表1），并经山东中医药大学药学院中药鉴定教研室徐凌川教授分别鉴定为泰山白首乌C.bungeiDecne.、耳叶牛皮消C.auriculatumRoyle ex Wight.和隔山消C.wilfordii(Maxim.) Hemsl.，密封存放于4 ℃冰箱。

表1 25 批白首乌样品来源

1.2 色谱条件

岛津LC-20AD 高效液相色谱仪，Diamonsil C18(4.6 mm×250 mm, 5 μm)；流 动 相 为 甲 醇-0.1%磷酸水溶液梯度洗脱（0～7 min，15%甲醇;7～18 min，15%～24%甲醇；18～27 min，24%甲醇；27～32 min，24%～30%甲醇；32～40 min，30%甲醇；40～45 min，30%～15%甲醇），流速为1 ml/min，柱温为30 ℃，检测波长为260 nm（4-羟基苯乙酮、白首乌二苯酮、2',4'-二羟基苯乙酮）和280 nm（2',5'-二羟基苯乙酮），进样量为10 μl。

1.3 实验方法

1.3.1 对照品储备液的制备

精确称取标准品4-羟基苯乙酮156.12 mg、2',5'-二羟基苯乙酮162.08 mg、白首乌二苯酮98.02 mg 和2',4'-二羟基苯乙酮133.45 mg，置于1 000 ml 容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度线，摇匀，制得混合对照品储备液。精密量取混合对照品储备液适量，用甲醇稀释10 倍，得到4-羟基苯乙酮、2',5-'二羟基苯乙酮、白首乌二苯酮和2',4'-二羟基苯乙酮质量浓度分别为0.015 61、0.016 21、0.009 802、0.013 34 mg/ml 的混合对照品溶液，过0.45 μm 微孔滤膜作对照品溶液，置于4 ℃冰箱中备用。

1.3.2 供试品溶液的制备

称取白首乌样品粉末（过五号筛）约2.0 g，精密称定，置于50 ml 具塞锥形瓶中，精密加入甲醇20.0 ml，密塞，称定重量，超声处理30 min，放冷，再称定重量，用甲醇补足超声过程中损失的重量，摇匀，滤过，再取续滤液，过0.45 μm 微孔滤膜，即得。

2 结果与讨论

2.1 色谱图及数据分析

取25 批白首乌样品，分别按实验方法制备供试品溶液，按“1.2”项色谱条件进行测定，得到25 个样品的HPLC 指纹叠加图谱及10 个共有峰，并对指纹图谱中的4 种苯乙酮类成分进行归属确认。其中，对4-羟基苯乙酮(保留时间19.531 min)、2',5'-二羟基苯乙酮(保留时间24.773 min)、白首乌二苯酮(保留时间26.455 min)和2',4'-二羟基苯乙酮(保留时间30.768 min)进行了指认，白首乌指纹图谱、对照图谱及混合对照品图谱如图2 所示。

图2 白首乌HPLC 色谱图

本研究采用国家药典委员会“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”（2012 A 版）对25 批白首乌样品的HPLC 指纹图谱进行数据分析处理，运用多点校正法对其指纹图谱进行相似度评价，选取S16 作为参照图谱，设置“时间窗宽度”为0.6 min，以平均数的方法生成白首乌共有模式的指纹对照图谱。在相似度评价中，25 批白首乌样品除了S1（产地山东济南）、S2（产地山东临沂）、S3（产地山东泰安）之外，其余相似度均在0.823～0.980 之间。故可以通过相似度分析初步将S1、S2、S3 这3 个批次的白首乌样品归为一类，从色谱图上可以看出其某些成分含量较低，与其他产地的白首乌差距明显，结果显示均为泰山白首乌。研究结果表明，可以明显将以上3 个批次的泰山白首乌与其他2 个种白首乌（滨海白首乌和隔山消）区分为2 大类，说明泰山白首乌与其它白首乌品种（滨海白首乌和隔山消）的化学成分差距显著。

相似度分析可以根据化学特征峰差异明显地区分泰山白首乌，但是滨海白首乌和隔山消不易区分。因此，将其他22 批次白首乌样品的10 个特征峰面积组成数据矩阵，导入SPSS 20.0 统计软件，采用组间联接法以及欧氏距离对指纹图谱进行聚类分析，结果如图3。结果表明，化学距离为2.5，可以将22 个样品分为2 类，第Ⅰ类的6 组均为隔山消，第Ⅱ类的16 组均为滨海白首乌。聚类分析结果表明，隔山消和滨海白首乌化学成分含量差异明显。

图3 22 批白首乌样品的化学聚类分析

为了评价22 批次样品所有成分的样品分辨能力，运用SIMCA 14.1 分析软件对其进行主成分分析，结果见图4。由PCA 图可以看出，S9、S13～S21、S25 聚为一类，S5、S7、S8、S12 聚为一类，S10、S22、S23、S24 聚为一类，与聚类分析的结果基本一致，样品之间的离散程度较大，表明样品差异性较大。

图4 22 批白首乌PCA 图

2.2 标准曲线的制备

精密吸取混合对照品溶液1、2、4、8、16、32 μl，分别注入高效液相色谱仪，在“1.2”项实验色谱条件下，重复进样3 次，测定4-羟基苯乙酮、2',5'-二羟基苯乙酮、白首乌二苯酮和2',4'-二羟基苯乙酮的峰面积，对结果进行线性回归分析，以各对照品浓度（X, μg）对峰面积（Y）绘制各标准曲线。线性关系考察结果见表2。

表2 线性关系考察结果

2.3 精密度实验

按“1.2”项色谱条件对混合对照品溶液，重复进样6 次，测定并计算4-羟基苯乙酮、2',5'-二羟基苯乙酮、白首乌二苯酮和2',4'-二羟基苯乙酮峰面积的RSD 分别为1.35%、1.15%、1.27%和1.37%。

2.4 稳定性实验

取混合对照品溶液，室温放置，按“1.2”项色谱条件，分别在0 h、2 h、4 h、6 h、12 h 和24 h 进样，测定并计算得到RSD 分别为0.99%、0.82%、0.92%和0.88%，RSD 值均小于3%，结果表明供试品溶液在24 h 稳定性良好。

2.5 重复性实验

取同一批白首乌（S16）样品粉末6 份，精密称定，按“1.3.2”项方法制备供试品溶液，按“1.2”项色谱条件测定，4-羟基苯乙酮、2',5'-二羟基苯乙酮、白首乌二苯酮和2',4'-二羟基苯乙酮峰面积的RSD 分别为1.48%、1.84%、1.13%和2.01%，RSD 值均小于3%，表明方法重复性良好。

2.6 加样回收率实验

精密称取同一批次白首乌（S16）样品粉末6 份，每份1.0 g，按1:1 质量比分别加入适量的4-羟基苯乙酮、2',5'-二羟基苯乙酮、白首乌二苯酮和2',4'-二羟基苯乙酮对照品，按照样品溶液的配制方法制备供试品溶液，在“1.2”项色谱条件下，测定并计算得到平均加样回收率（n=6）分别为97.77%、99.15%、98.81%和96.77%，RSD 分别为2.07%、1.57%、1.20%和1.19%，加样回收率结果见表3。

表3 加样回收率实验结果

2.7 样品含量测定

取25 个批次的白首乌各2.0 g，按照样品溶液的配制方法制备白首乌供试品溶液，进样后记录各色谱峰的峰面积，将所得数据代入各标准曲线回归方程计算其含量，结果如表4。不同批次白首乌中各化合物成分存在显著差异，总苯乙酮类成分的含量也不同。

表4 25 批白首乌中苯乙酮类化学成分含量测定结果(n=3，mg/g)

泰山白首乌历来被认为是白首乌的正品，而隔山消和滨海白首乌尽管也用作白首乌，但仍被认为是泰山白首乌的近缘品种。本研究发现，隔山消中总苯乙酮类成分的含量最高，滨海白首乌次之，泰山白首乌最低，总苯乙酮含量仅为隔山消的20%（图5）。栽培的隔山消中总苯乙酮含量与野生的相差不大，说明隔山消野生变家养驯化成功。

图5 不同物种白首乌中苯乙酮类化学成分含量

滨海白首乌是目前流通的主流品种，江苏滨海、湖南、安徽、四川等地均有栽培，含量差异不大，然而野生的滨海白首乌总苯乙酮含量显著高于栽培品，说明该品种的种植存在着改良的空间，可以从种植环境、栽培技术等方面予以改进。

3 结论

本研究通过建立白首乌指纹图谱来评价白首乌药材的品质，对25 批次不同白首乌的4 种苯乙酮类指标性成分进行含量测定分析，并对其方法学进行考察。HPLC 指纹图谱中相似度和聚类分析研究表明，泰山白首乌、滨海白首乌及隔山消的化学成分差异显著。HPLC 含量测定分析发现，隔山消中总苯乙酮类的含量明显高于滨海白首乌和泰山白首乌。后续可以对3 种白首乌的植物基源、化学成分、药理及毒理作用进行综合对比研究，为滨海白首乌和隔山消是否可以替代泰山白首乌作为白首乌正品药材应用，提供理论依据。