短时两次取精精子动态参数的差异性分析

刘永杰，石冬梅，代良，张帆，王国平

体外受精-胚胎移植（in vitro fertilizationembryo transfer，IVF-ET）技术是指将女性卵子取出，在体外受精发育形成胚胎，再将胚胎移植回宫腔。IVF 过程中，在每个卵子周围加入5 万～10 万条精子，以保障卵子能够受精，即足量有活力的精子和成熟的卵子是受精成功的关键［1］。若IVF 取卵当日出现单次所取的精子质量下降，只能转为卵泡浆内单精子注射（intracytoplasmic sperm injection，ICSI），增加了配子体外操作过程，导致费用和子代表观遗传学异常风险增加［2］。为提升精子质量和改善患者取精状态，多数患者依靠药物以保证取卵日的精子质量。然而，取卵日的突发精子质量下降这一问题仍无法避免。若男性可在短时间二次取精，可将短时间两次精液中有活力的精子合并使用，就有机会获得足够有活力的精子，避免IVF转为ICSI，减少人为干预，从而提高出生人口质量［3］。然而，健康男性短时间内两次取精精液质量的相关研究较少。Barbagallo 等［4］荟萃分析19 项研究发现，少弱精子症患者4 h 内第2 次所取精液较第1 次精液的精子浓度显著增加，而精子DNA 完整性却显著降低。为探究短时二次取精的价值，本研究选取我院健康体检男性，分析在短时间内取精前后两次精液的质量状况和精子动态参数，为助孕提供理论基础。

1 对象与方法

1.1 研究对象 选取2022年7—8月就诊于银川市妇幼保健院生殖中心男科门诊的48例健康体检男性，经超声检查双侧睾丸、附睾、精索未见异常，否认肝炎、结核、腮腺炎等系统性疾病史，否认放射线和化学物品接触史，无泌尿生殖系统感染、畸形和精索静脉曲张。年龄25～35岁，平均（28.94±3.62）岁。本研究已通过银川市妇幼保健院伦理委员会批准（市妇幼伦理第2021-50），所有受试者均签署知情同意书。

1.2 精液分析 研究对象禁欲2～7 d，在院内取精室手淫取精液，在第1 次取精后1 h，再次手淫取精液。精液置于无菌杯中，36 ℃温箱30～60 min液化。采用电子天平称取精液质量，精液液化后，采用计算机辅助精子分析系统（北京，清华同方MX7.8.5-T）分析精子浓度、前向运动精子比例、直线运动精子比例。精子动态参数：平均曲线运动速度（curvilinear velocity，VCL）、平均直线运动速度（straight-line velocity，VSL）、平均路径运动速度（average path velocity，VAP）、精子平均侧摆幅值（amplitude of lateral head displacement，ALH）、精子平均鞭打频率（beat-cross frequency，BCF）、精子平均移动角度（mean angular displacement，MAD）、运动的直线性（linearity，LIN）、运动的摆动性（wobble，WOB）、运动的前向性（straightness，STR）。

1.3 精浆锌、果糖、α-葡萄糖苷酶含量检测 液化的精液动态分析后900 r/min离心10 min，留取上层精浆待测。精浆锌含量采用2-（5-溴-2-吡啶偶氮）-5-（N-丙烷-N-磺基丙基氨）-苯酚（5-Br-PAPS）法检测，精浆果糖含量采用己糖激酶法检测，精浆α-葡萄糖苷酶含量采用改良Cooper法检测，所有试剂均购自深圳市博瑞德生物科技有限公司，检测严格按照说明书操作。

1.4 统计学方法 采用SPSS 17.0 软件进行数据分析，非正态分布数据采用M（P25，P75）表示，2 组间比较采用Mann-WhitneyU检验；各指标间的相关关系采用Spearman法分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两次取精精液各指标变化 第1次取精的精液量、直线运动精子比例、精子总数、前向运动精子总数、直线运动精子总数、VCL、VAP、BCF、精浆锌和α-葡萄糖苷酶水平均高于第2 次取精精液（P＜0.05）；两次精液的精子浓度、前向运动精子比例、VSL、ALH、MAD、LIN、WOB、STR和精浆果糖水平差异无统计学意义，见表1。

Tab.1 Comparison of seminal fluid indexes between two times of sperm extraction表1 2次取精精液各指标的比较（n=48）

2.2 精液量与精子各动态参数的关系 第1次取精的精液量与BCF 呈正相关（P＜0.05），第2 次取精的精液量与VCL、VSL、VAP、ALH、MAD、WOB 呈负相关（P＜0.05），见表2。

Tab.2 Correlation between semen volume and sperm dynamic parameters at different extraction times表2 2次取精的精液量与精子动态参数的相关性（rs）

2.3 精子浓度、前向运动精子比例与精子各动态参数的关系 总体的精子浓度与ALH、BCF、MAD、LIN、WOB、STR 呈正相关（P＜0.05）；第1 次取精的精子浓度与BCF 呈正相关，第2 次取精的精子浓度与所有精子的动态参数均呈正相关（P＜0.05），见表3。除第1次取精的BCF外，总体、第1次及第2次取精前向运动精子比例与其余精子的动态参数均呈正相关（P＜0.05），见表4。

Tab.3 Correlation between sperm concentration and sperm dynamic parameters at different extraction times表3 2次取精的精子浓度与精子动态参数的相关性（rs）

Tab.4 Correlation between the proportion of forward motile sperm and sperm dynamic parameters at different extraction times表4 2次取精的向前运动精子比例与精子动态参数的相关性（rs）

2.4 精浆锌、果糖、α-葡萄糖苷酶水平与精子各动态参数的关系 总体和第1 次精液的精浆锌、精浆果糖及α-葡萄糖苷酶均与BCF 呈正相关（P＜0.05）；第2 次精液的精浆果糖与BCF 呈正相关（P＜0.05），精浆α-葡萄糖苷酶与VCL 和VAP 呈负相关（P＜0.05），见表5—7。

Tab.5 Correlation between seminal plasma zinc and sperm dynamic parameters at different extraction times表5 2次取精的精浆锌与精子动态参数的相关性（rs）

Tab.6 Correlation between spermatodynamic parameters and spermatozoa saccharide at different extraction times表6 2次取精的精浆果糖与精子动态参数的相关性（rs）

Tab.7 Correlation between glucosidase and sperm dynamic parameters at different extraction times表7 2次取精的精浆α-葡萄糖苷酶与精子动态参数的相关性（rs）

3 讨论

睾丸产生的精子经附睾逐渐成熟后获得运动能力，与此同时，因细胞凋亡和氧化应激损伤导致一部分精子活动力下降［5］；精子在附睾中存留时间越长，精子质量下降就越严重。WHO 建议禁欲2～7 d 行精液分析［6］。大量研究也证实禁欲2～7 d可以获得最佳的精子［7-9］。Rosenkjær 等［10-11］认为短时二次所取的精液虽然精液量、精子浓度和精子总数明显下降，但前向运动精子比例却明显升高。本研究发现，短时二次所取精液的精液量、直线运动精子比例、精子总数等较第1 次精液降低，与既往研究一致［12］。而两次精子浓度水平差异无统计学意义，可能与研究对象均为正常人群有关。由于个人心理状况导致每个人的取精状态完全不同，正常人群更容易调节自身心理快速适应环境，在任何禁欲时间内取到精液的精子浓度波动较小［13］。

精子质量是影响精卵结合的关键因素之一，其决定于精子的数量、运动能力、顶体反应及核DNA完整情况。9项精子动态参数中，VCL、VSL、VAP代表精子前进的速度，ALH、MAD、WOB代表精子与卵子结合的方向、LIN、STR代表精子运动的方向，BCF代表精子前进的动能［14-15］。本研究发现第2次精液VCL、VAP、BCF 较第1 次精液降低，而两次精液的VSL、ALH、MAD、LIN、WOB、STR 差异无统计学意义。由此推测，第2 次所取精液中精子前进的动能和速度均较第1 次差，故可抵达卵子的精子数量会少，但由于精子运动的方向和与卵子结合的方向无差异，故可以抵达卵子的精子，其与卵子结合能力是一样的。

精液中精囊腺液、前列腺液、附睾液分别约占60%、30%和8%。临床上可通过测定精浆中果糖、锌及α-葡萄糖苷酶的含量分别评估精囊腺、前列腺及附睾的功能状态［16］。睾丸产生的无活动能力精子只有在附睾中进一步成熟才能获得尾部鞭打和前向运动的能力，利用精囊腺的能量以及前列腺的活化作用形成有受精潜质的精子［17］。本研究发现，总体和第1 次取精精液量、精浆锌和α-葡萄糖苷酶与BCF 呈正相关，且第2 次精液的精浆锌和α-葡萄糖苷酶含量显著低于第1 次；总体、第1 次及第2 次精液精浆果糖与BCF均呈正相关，但第1次和第2次精液果糖的差异无统计学意义。这可能因禁欲时间短，附睾和前列腺中促进精子成熟的相关物质未能完全分泌［18］，导致精子前向鞭打能力不能充分体现［19］，但精囊腺可以在短时间内分泌足够精子所需能量物质，所以第2 次精液中尚存在一定数量有受精能力的精子。由于实验室中精子和卵子结合使用的受精液中有大量保护精子的成份，因此建议在行IVF 助孕时，取卵日二次所取精液应该立即将精子从精浆中分离出来，并加入受精液中予以保护，以避免精浆成分不完整造成对精子的影响［18，20-21］。

综上所述，虽然短时第2 次所取精液中精子整体的运动能力较第1 次明显下降，但并不影响活动精子与卵子的结合能力，可以作为IVF的有效补充。