响应面法优化苦胆草多糖脱色工艺

黄丽金 李自霖 陈贵元

摘要 为了确定过氧化氢法脱除苦胆草多糖中色素的最佳工艺，以多糖脱色率、多糖保留率2个指标的综合评分为考查指标，在单因素试验的基础上，响应面优化过氧化氢法脱除苦胆草多糖中色素的工艺条件。结果表明，过氧化氢法色素最佳工艺为脱色温度55 ℃，脱色时间209 min，过氧化氢体积分数2.73%，脱色1次。在该工艺条件下脱除色素，得到多糖脱色率为72.43%，多糖保留率为87.24%，综合评分为79.8，与预测值80.08相比，误差为0.3%。回归方程与实际情况拟合较好，表明该脱色工艺稳定可靠。

关键词 苦胆草多糖；响应面法；过氧化氢；脱色工艺

中图分类号 R283   文献标识码 A

文章编号 1007-7731（2023）09-0157-05

Abstract To determine the best process of removing pigment from Radix gentianae polysaccharide by hydrogen peroxide. Based on the single factor test， response surface method was used to optimize the process conditions for the removal of pigment from Radix gentianae polysaccharide by hydrogen peroxide. The results showed that the optimal process of the hydrogen peroxide method was decolorization temperature 55 ℃， decolorization time 209 min， hydrogen peroxide volume fraction 2.73%， and decolorization once. Depigmentation under the process conditions， the depigmentation rate of polysaccharide was 72.43%， the retention rate of polysaccharide was 87.24%， and the comprehensive score was 79.8， compared with the theoretical 80.08， the error was 0.3%. The regression equation fits well with the actual situation， indicating that the decolorization process is stable and reliable.

Keywords Radix gentianae polysaccharide; response surface method; hydrogen peroxide; depigmentation process

苦膽草（Radix gentianae），别名穿心莲，属爵床科一年生药用植物，性寒、味苦，具有清热解毒、抗炎止痛等功效，全草均可入药，是一种传统的中药植物资源[1]，广泛分布于福建、广东、云南等地区[2]。苦胆草含有多糖、黄酮、多酚、内酯等多种活性成分[3-5]。苦胆草多糖的提取工艺和生物活性研究目前还鲜有报道[5-7]，苦胆草多糖脱色工艺的研究则尚未见报道。

多糖的提取方法众多[8]，植物多糖多为水溶性分子，通常采用水作为溶剂进行浸提，提取多糖的同时常将水溶性色素浸提出来换入多糖中，使多糖颜色较深。色素的存在不仅干扰多糖的纯度，还影响多糖的分离纯化、结构分析以及生物活性等方面的研究[9]，因此有必要对多糖进行脱色处理。多糖的脱色方法主要有过氧化氢法、活性碳法以及大孔树脂等，不同的脱色方法对脱色率、多糖保留率乃至多糖活性都有影响[10-13]。植物多糖含有的色素物质大多是水溶性的，且结构多以负离子形式存在[14]。过氧化氢的水溶液能够电离出过氧氢根离子，能够氧化水溶性色素负离子达到脱色效果，且对多糖的结构及活性破坏较小[15-16]。基于此，本研究拟采用过氧化氢法脱除苦胆草多糖中的色素，响应面法优化脱色工艺，为苦胆草多糖分离纯化、结构鉴定以及生物活性的研究提供基础资料。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

苦胆草购于大理市中药材市场；葡萄糖标准品购自北京奥博星生物技术有限责任公司；蒽酮、浓硫酸、30%过氧化氢均为国产分析纯（AR）。

1.2 主要仪器

BT-224S型电子分析天平（德国赛多利斯仪器公司），恒温水浴锅（上海博迅达实业有限公司），B600型低速离心机（上海医用分析仪器厂），SP-722可见分光光度计（上海光谱仪器有限公司）。

1.3 试验方法

1.3.1 苦胆草多糖的提取。工艺流程如下：苦胆草干粉→萃取回流→热水浸提→浓缩→脱蛋白→乙醇沉淀→离心、洗涤→冷冻干燥→得到苦胆草多糖粗品。具体提取方法参考徐兵[7]文献进行。

1.3.2 葡萄糖标准曲线的制作。参照文献[17]绘制葡萄糖标准曲线，称取葡萄糖标准品100 mg，加蒸馏水定容至1 000 mL，得0.1 mg/mL的葡萄糖标准溶液。分别取0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL标准液，加去离子水补至2 mL，在冰水浴中每管加入4 mL 0.5%的蒽酮浓硫酸试剂，混匀，沸水浴中加热10 min，室温静置10 min。在620 nm波长处测定吸光度。以葡萄糖质量浓度（mg/mL）为X轴，吸光度（A）为Y轴，绘制标准曲线，得回归方程：Y=0.014 2X+0.011 5，R2=0.995 2，表明在0～0.06 mg/mL葡萄糖浓度范围内，线性关系较好，表明该标准曲线可用于后续试验葡萄糖浓度测定。

1.3.3 脱色率的测定。精密称取0.6 g苦胆草多糖干粉，去离子水定溶至100 mL。取过滤多糖溶液使用紫外分光光度计进行全波长扫描，未得到合适的最大吸收峰值，由于溶液颜色为深褐色，按照溶液的互补色选取560 nm作为检测波长[18]。过氧化氢对苦胆草多糖的脱色率按下列公式计算：

式中：D表示脱色率，%；A0为苦胆草多糖溶液过氧化氢脱色前在560 nm 处的吸光度；A1为苦胆草多糖溶液过氧化氢脱色后在560 nm处的吸光度。

1.3.4 多糖保留率的测定。参照文献[17]的方法，在波长620 nm处测定吸光度，利用葡萄糖标准曲线计算多糖质量浓度。代入下式计算多糖的保留率：

式中：R表示多糖保留率，%；C1为过氧化氢脱色后苦胆草多糖质量浓度，mg/mL；C0为过氧化氢脱色前苦胆草多糖质量浓度，mg/mL。

1.3.5 脱色效果评价。采用综合加权评分法[19]评价苦胆草多糖的脱色效果，将多糖脱色率（D）和多糖保留率（R）两者的权重值均设为50，总分计算为100分，其综合评分按照下列公式计算：

式中：M表示多糖脫色率和多糖保留率的综合评分，分；D表示脱色率，%；Dmax表示脱色率的最大值，%；R表示多糖保留率，%；Rmax表示多糖保留率的最大值，%。

1.3.6 单因素试验。在固定脱色温度50 ℃、脱色时间3 h、过氧化氢体积分数3%、脱色1次的基础上，进行单因素试验，分别考察脱色温度、脱色时间、过氧化氢体积分数3个因素对多糖脱色率和保留率的影响。

1.3.7 响应面试验设计。在单因素试验基础上，选取脱色温度（A）、脱色时间（B）、过氧化氢体积分数（C）为考察因素，以多糖脱色率和多糖保留率的综合评分（Y）为考察指标，采用3因素3水平响应面试验法优化苦胆草多糖的脱色工艺。因素水平见表1。

1.4 数据处理

每个试验均重复3次，采用Design Expert 10.0、Excel 2010、Origin 9.0等软件对数据进行统计分析和绘图。

2 结果与分析

2.2 单因素试验

2.2.1 脱色温度对多糖脱色率和多糖保留率的影响。如图1可知，在30～70 ℃范围内，随着温度的升高，多糖脱色率不断增加，多糖保留率则不断下降。可能是随着温度的升高，过氧化氢氧化色素的能力不断增强，但是温度过高可能会引起多糖水解，导致多糖损失较大。当脱色温度低于50 ℃时，多糖保留率较高，但脱色率低；当温度超过50 ℃，脱色率急骤升高，但多糖保留率则显著下降。在脱色温度为50 ℃时，多糖脱色率为64.77%，多糖保留率为85.82%，两者都得到兼顾，因此选择50 ℃作为脱色温度开展后续单因素试验。综合考虑，选择脱色温度40、50、60 ℃进行响应面试验。

2.2.2 过氧化氢体积分数对多糖脱色率和多糖保留率的影响。由图2可知，随着过氧化氢用量的增加，脱色率不断地增加，多糖保留率不断下降，在过氧化氢体积分数小于3%，脱色率大幅度增加，过氧化氢体积分数大于3%之后多糖脱色率上升缓慢，可能是过氧化氢与色素的结合达到饱和状态。与此同时，随着过氧化氢体积份数的增加，多糖保留率不断降低，可能是过氧化氢的强氧化性破坏多糖结构，导致多糖损失。在过氧化氢体积分数为3%时，多糖脱色率为67.73%，多糖保留率为83.39%。为避免多糖过多的损失以及保证脱色效果，选取过氧化氢体积分数3%开展后续单因素试验。综合考虑，选择过氧化氢体积分数2%、3%、4%开展响应面试验。

2.2.3 脱色时间对多糖脱色率和多糖保留率的影响。如图3可知，随着时间的延长，脱色率不断增加，多糖保留率则不断下降。脱色时间小于3 h，脱色率增加显著，在超过3 h之后，脱色率增加趋缓。这可能是过氧化氢与色素分子的结合会出现饱和状态，所以脱色一定时间后，脱色率就会逐渐趋缓。随着过氧化氢脱色作用时间的增加，过氧化氢也会氧化破坏多糖分子，造成多糖损失。因此考虑时间成本以及多糖的保留率，选择脱色时间为2、3、4 h进行响应面试验。

2.3 响应面试验结果

响应面试验结果见表2，方差分析结果见表3。采用Design Expert 10.0软件分析表2中的试验数据，得到综合评分（Y）与脱色温度（A）、脱色时间（B）、过氧化氢体积分数（C）的相关性拟合方程：Y=77.93+4.76A+2.50B+0.30C+0.28AB+0.78AC+0.49BC-2.89A2-1.71B2-0.70C2。

由表3可知：该模型的P<0.01，表明该回归方程极显著，提示试验设计可靠。失拟项P值为0.422 1 P>0.05，提示该回归方程拟合度较好。脱色温度（A）、脱色时间（B）以及脱色温度的二次项（A2）对多糖脱色的综合评分具有极显著影响（P<0.01）；脱色时间的二次项（B2）对多糖脱色的综合评分具有显著影响（P<0.05），提示改变这些因素的条件会使响应值（综合评分）产生显著变化。回归方程的交互项AB、AC、BC的P>0.05，表明各交互项对综合评分的影响不显著，提示3个因素无交互作用。

根据表3中F值的大小，提示各因素对响应值（综合评分）的影响强弱为脱色温度（A）>脱色时间（B）>过氧化氢体积分数（C）。其中脱色温度对响应值的影响最大。模型R2=0.968 6，R2Adj=0.928 2，均大于0.9，表明该模型预测值与实测值较为接近，表明该模型能很好地模拟真实的试验过程。

2.4 验证试验

根据软件Design-Expert 10.0预测的最优脱色工艺条件为：脱色温度54.63 ℃，脱色时间208.53 min，过氧化氢体积分数为2.73%。多糖脱色率的理论预测值为70.11%，多糖保留率为90.04，综合评分为80.08。为了便于实际操作，将各因素修正为：脱色温度55 ℃，脱色时间209 min，过氧化氢体积分数为2.73%，脱色1次。在该工艺条件，进行3次平行试验，取均值，得到多糖脱色率为72.43%，多糖保留率为87.24%，综合评分为79.84，与预测值80.08相比，误差为0.3%，表明该脱色工艺稳定可靠，可用于苦胆草多糖色素的脱除。

3 结论

过氧化氢方法脱色素具有操作简便、脱色率高的优势，适用于脱除带负电荷的水溶性色素[14]。本研究通过过氧化氢法对苦胆草多糖进行响应面脱色试验，以多糖脱色率和多糖保留率2个指标确定了单因素试验中脱色温度、脱色时间、过氧化氢用量的最佳参数。在单因素试验基础上，响应面试验优化苦胆草多糖过氧化氢脱色工艺，得到最佳脱色工艺为：脱色温度55 ℃，脱色时间209 min，过氧化氢体积分数为2.73%，脱色1次。在此条件下，多糖脱色率达到72.43%，多糖保留率为87.24%，综合评分为79.8。表明该工艺稳定可靠、操作简单，适用于工业化生产中苦胆草多糖色素的脱除。

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（责编：张宏民）

基金项目 国家自然科学基金项目（31860252）；云南省自然科学基金高校联合面上项目（2017FH001-084）；云南省昆虫生物医药研发重点实验室开放项目（AG2022006）。

作者简介 黄丽金（1998—），女，福建上杭人，在读硕士。研究方向：植物多糖分离提取及功能。