微波消解-电感耦合等离子体质谱法测定DPP-4 抑制剂原料药中7 种元素杂质

乔敏莎，郑秋莹，乔晓娜，张绿茵，兰为环，路晓慧，潘晓男

（天士力医药集团股份有限公司研究院，天津 300410）

2 型糖尿病（T2DM），又名非胰岛素依赖型糖尿病，是由于体内血糖水平提高而引发的代谢障碍性疾病[1]。它不仅会增加缺血性心脏病、中风等风险，而且还会对患者的身体健康构成巨大的威胁，甚至危及其生命[2-5]。近年来，二肽肽酶-IV 抑制剂已成为2型糖尿病的一种前沿治疗方法[6-7]，它不仅可以保持人体血糖水平的稳定性，而且还可以抑制胰岛β 细胞的生长，进而达到调节内分泌、促进代谢、减轻高血糖并预防糖尿病发生的目的，这一优势远远超过了传统的药物[8]。

药品生产过程中的元素杂质一旦进入人体，会对人体的正常新陈代谢和生理功能产生严重的损害[9-10]，因此，在药品生产过程中对元素杂质进行全面的风险评估，严格控制元素杂质的含量至关重要。无机元素的检测方法主要包括原子吸收光谱法（AAS）、原子吸收光谱法（ICP-AES）和电感耦合等离子体质谱法（ICP-MS）等，其中，ICPMS 法则拥有更加出色的抗干扰特性、更高的灵敏度、更宽的线性范围以及更加高效的分析速率，因此，它已成为痕量元素的最佳检测设备。

TSL0319 是在研的1.1 类DPP-4 抑制剂新药。作者根据ICHQ3D《元素杂质指南》要求，对自研DPP-4 抑制剂原料药的整个制备过程进行元素杂质风险评估，然后在文献[11-14]的基础上，建立微波消解-ICPMS 法测定其原料药中1 类和2A 类共7 种元素杂质（汞、镍、钴、镉、钒、砷、铅）的方法，旨在为DPP-4 抑制剂的药物质量标准研究提供支持。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

仪器：iCAP Q 型电感耦合等离子体质谱仪，美国赛默飞世尔公司；MARS6 型微波消解仪，美国CEM 公司；Milli-Q 型纯水机，美国密理博公司；XS205DU型电子分析天平，瑞士梅特勒-托利多公司。

试剂：硝酸，优级纯，德国默克公司；过氧化氢，优级纯，上海远大过氧化物有限公司；盐酸，优级纯，美国密理博公司；Ge、In、Bi、Au、Hg、Ni、Co、Cd、V、As、Pb 元素标准溶液，浓度为1 000 mg·L-1，国家有色金属及电子材料分析测试中心；超纯水，通过纯水机制备，电阻率18.2 mΩ·cm-1。

1.2 仪器工作条件

微波消解条件：消解温度程序为：0～ 10 min，由室温上升至180 ℃；10～ 20 min，由180 ℃上升至200 ℃，20～ 35 min，消解温度保持在200 ℃；消解功率设置为自动。

ICPMS 仪器条件：仪器功率1.55 kW；气体流量：雾化气1.0 L·min-1，冷却气14.0 L·min-1；辅助气0.8 L·min-1；蠕动泵转速40 r·min-1，采样锥和截取锥均为镍锥；采样深度为5.0 mm；采用KED 碰撞池模式；重复测定次数3 次；积分时间0.023 s。内标法定量，即测定标准溶液及样品溶液时，在线添加内标溶液。

1.3 实验步骤

1.3.1 溶液的配制

内标溶液的配制：精密量取锗、铟、铋单元素标准溶液适量，用2%硝酸溶液稀释得到每1 mL 含锗20 ng、铟0.5 ng、铋0.5 ng 的混合溶液。

金标准溶液配制：精密量取金单元素标准溶液适量，用2%硝酸溶液稀释得到每1 mL 含金25 μg的溶液。

标准储备溶液的配制：分别精密量取镉、铅、砷、汞、钴、钒、镍单元素标准溶液适量，用2%硝酸溶液稀释得到每1 mL 分别含镉、铅、砷、汞、钴、钒、镍 为250 ng、250 ng、750 ng、1 500 ng、2 500 ng、5 000 ng、10 000 ng 的标准储备母液，然后用硝酸稀释10 倍，即得标准储备溶液。

标准曲线系列溶液的配制：精密量取标准储备溶液适量，置于50 mL 容量瓶中，精密加入金标准溶液200 μL，用2%硝酸溶液稀释，制成每1 mL 分别含镉0 ng、0.15 ng、0.25 ng、0.5 ng、0.75 ng、1 ng，含铅0 ng、0.15 ng、0.25 ng、0.5 ng、0.75 ng、1 ng，含砷0 ng、0.45 ng、0.75 ng、1.5 ng、2.25 ng、3 ng，含 汞0 ng、0.9 ng、1.5 ng、3 ng、4.5 ng、6 ng，含钴0 ng、1.5 ng、2.5 ng、5 ng、7.5 ng、10 ng，含钒0 ng、3 ng、5 ng、10 ng、15 ng、20 ng，含 镍0 ng、6 ng、10 ng、20 ng、30 ng、40 ng 的系列混合标准溶液。此溶液现用现配。

供试品溶液的制备：精密称取0.2 g 原料药，放入消解罐中，然后加入5 mL 浓硝酸（体积比为65%），加盖密封后进行微波消解。待消解完成并降温后，缓慢打开消解罐盖子，将消解液转移至50 mL容量瓶中，精密添加200 μL 金标准溶液，然后用2%硝酸溶液稀释至刻度，摇匀，即得。

空白溶液的配制：制备方法同供试品溶液，但不加金标准溶液。

元素对照品溶液的配制：精密量取1 mL 混合元素标准储备溶液，用2%硝酸稀释至50 mL，摇匀，即得。

加标供试品溶液的配制：精密称取0.2 g 原料药，放入消解罐中，精密加入100 μL 混合元素标准储备母液，加入5 mL 浓硝酸（体积比为65%），加盖密封后进行微波消解。消解后的处理步骤同供试品溶液制备方法。

1.3.2 方法学考察步骤

专属性：取“1.3.1 项”的供试品溶液、空白溶液、元素对照品溶液和加标供试品溶液，分别上机测试，记录响应值，然后分别比较对照品溶液与空白溶液、加标供试品溶液与供试品溶液的响应值是否有明显差异。

标准曲线：依次测定系列浓度的标准溶液，以测量值（3 次读数的平均值）为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。

检出限：按“1.3.1 项”配制10 份空白溶液，分别上机测试，记录空白溶液的响应值，按照式（1）计算所对应的各元素的浓度作为检测限。

式中LOD——检测限；

SD——目标元素与内标响应值比值的标准偏差；

b——标准曲线的斜率。定量限：按“1.3.1 项”配制10 份空白溶液，分别上机测试，记录空白溶液的响应值，按照式（2）计算所对应的各元素的浓度作为定量限。

式中LOQ——定量限；

SD——目标元素与内标响应值比值的标准偏差；

b——标准曲线的斜率。重复性：按“1.3.1 项”分别配制6 份加标供试品溶液，注入仪器中，计算各元素含量的RSD值。

准确度：精密称取已知浓度的原料药样品9 份，每份约0.2 g，分成3 组。每组分别精密加入至30%限度浓度、100%限度浓度、150%限度浓度的混合元素标准储备溶液。然后在“1.2 项”条件下处理得到准确度测试用的供试品溶液，上机测试，计算各元素的回收率以及含量的RSD值。

中间精密度：不同实验人员于不同日期配制“1.3.1 项”溶液，并测定加标供试品溶液，计算RSD值。

系统适应性：精密量取1.5 mL 混合元素标准储备溶液，用2%硝酸溶液稀释至50 mL，摇匀，得到系统适应性溶液。然后取系统适用性溶液于供试品溶液分析前后分别进行检测，记录浓度值，并计算偏移值，计算公式如下：

式中C前——样品分析前系统适用性溶液的浓度；

C后——样品分析后系统适用性溶液的浓度。

2 结果与讨论

2.1 方法优化

实验比较了不同的酸体系对样品的消解效果，发现使用王水（浓盐酸∶浓硝酸=3 ∶1）消解样品时7 种元素的重复性优于硝酸消解效果，均低于2%，但75As 和51V 的回收率较差，经分析，75As 存在40Ar·35Cl 干扰、51V 存在35Cl·16O 干扰，而双氧水和硝酸的混合体系同样存在加标回收率差的问题。因此，从方法学准确度和试剂使用安全性的角度考虑，选择纯硝酸体系作为消解液，进行样品的微波消解前处理。

实验采用内标实时校正的方式进行检测，保证分析方法的精度，并采用KED 模式进行分析，该模式具有动能歧视和质量筛选功能，能够有效地降低基质干扰。另外，实验同时测定记忆效应非常强的Hg元素，为保证Hg 元素检测的准确性和记忆效应的消除，添加了Au 标准液作为稳定剂。

2.2 专属性

专属性结果如表1 所示。实验表明，对照品溶液与空白溶液相比，加标供试品溶液与供试品溶液相比，均有明显响应，符合要求。

表1 7 种元素的专属性结果Tab.1 Results of Specific for 7 elements

2.3 标准曲线、线性范围及检出限

各元素的线性、范围及检出限、定量限如表2所示。结果表明，7 种元素标准曲线的线性关系良好，相关系数均在0.999 3～ 0.999 9，检出限低于0.013 ng·mL-1，定量限低于0.038 ng·mL-1，满足分析要求。

表2 标准曲线、线性范围、检出限及定量限Tab.2 Standard curves，linear ranges，limit of detection and limit of quantitation

2.4 重复性

表3 为7 种元素重复性实验结果。可以看出，所测7 种元素的RSD 值均在3.0%以内，说明该方法具有良好的重复性。

表3 重复性实验结果Tab.3 Result of repeatability test

2.5 准确度

表4 是7 种元素的准确度结果。实验表明，各元素的回收率在92.27%～ 107.58%，即在70.0%～ 150.0%，重复性低于5.0%，符合痕量分析要求。

表4 加标回收率实验结果Tab.4 Results of the recovery rate

2.6 中间精密度

不同日期及不同操作人员进行中间精密度实验，结果表明，51V、59C o、60N i、75A s、111Cd、202Hg、208Pb 7种元素的加标回收率范围分别是98.21%～ 107.16%、97.77%～ 106.55%、9 7.5 2%～ 1 0 6.4 1%、9 5.7 0%～ 1 0 6.6 1%、9 5.0 4%～ 1 0 4.2 6%、9 3.6 8%～ 1 0 3.2 4%、91.67%～ 112.90%，均在70.0%～ 150.0%；7个元素的重复性均低于3.57%，即不大于USP233中规定的25.0%，说明方法的中间精密度符合分析要求。

2.7 系统适应性

表5 是进样前后系统适用性溶液检测结果及偏移值结果，从表中可以看出，各元素的偏移值均小于20.0%，说明方法的系统适应性良好。

表5 系统适应性结果Tab.5 Results of the system adaptation

2.8 原料药中元素杂质测定结果

限度用标准曲线法计算，本品每1 g 含镉不得过35 μg，含铅不得超过35 μg，含砷不得超过107 μg，含汞不得超过214 μg，含钴不得超过257 μg，含钒不得超过714 μg，含镍不得超过1 428 μg。按实验建立的方法，对三批原料药中7 种元素杂质进行测定，结果如表6 所示。实验表明，三批原料药的定量结果远远低于标准中的限度要求。

表6 样品中各元素含量Tab.6 Concentrations of the seven elements in samples

3 结束语

本研究通过微波消解-电感耦合等离子体质谱建立了DPP-4 抑制剂原料药中钒、钴、镍、砷、镉、汞、铅7 种元素杂质的含量测定方法，并对方法学进行了全面的验证。实验表明，所建立方法的线性、重复性、加标回收率、专属性、中间精密度等均符合分析要求，测定的3 批样品中7 种元素的含量均远小于其限度值。因此，该方法稳定、准确、可靠，可用于DPP-4抑制剂原料药中元素杂质的分析检测，也可为药物的质量控制研究提供参考依据。