‘甜蜜蓝宝石’葡萄组培技术研究

周 闰，杨 亚，骆夏辉，刘跃荣，彭丁文，刘 伟，申超峰，徐 严

（郴州市农业科学研究所/湖南省农业科学院郴州分院，湖南郴州 423000）

葡萄作为重要的经济类果树作物之一，具有悠久的栽培历史和丰富多样的品种，是世界第二大水果。我国作为葡萄（Vitis viniferaL.）的生产大国之一，葡萄的栽培面积和产量均居世界前列[1]。‘甜蜜蓝宝石’是近几年所研发的一种葡萄新品，别名‘月光之泪’，该品种属于欧亚种，天然无核，果色蓝黑，果肉脆滑，果粒果穗着色均匀一致，果皮轻薄，果肉有淡淡的玫瑰及牛奶香味。果粒为长圆形，最长的超过了5.5 cm，平均粒质量7.7 g，最大的果粒质量在10 g 以上，果穗较大，穗质量2～3 kg，最高产量可达4 000 kg/667 m2。‘甜蜜蓝宝石’优质、丰产、耐储运，且抗病性强于其它欧亚种，近几年的市场销量形势喜人，栽培该品种的果农数量急剧增加[2]，鉴于近年市场对种植蓝‘甜蜜蓝宝石’葡萄品种的急切需求，快速扩繁该品种有助于获得较高的经济效益。

葡萄主要通过扦插和嫁接等无性繁殖方法进行繁殖，虽然该方法具有简捷方便的特点，但受到区域、季节变化的局限，且容易被病毒感染，最终导致葡萄品种的种性严重退化[3-5]。组织培养则能保持亲本特性并在短期内大量繁殖，加快市场上优质种苗的推广速度[6]，同时，茎尖接种还可得到部分脱毒的优质种苗，一直以来，利用组织培养繁育优良品种一直是葡萄苗木生产的研究重点[7]。培养基成分与激素的配比能够影响外植体的启动培养和繁殖体的增殖效率，研究表明，添加2 mg/L 6-卞氨基嘌呤（6-BA）和0.2 mg/L 萘乙酸（NAA）的MS 培养基作为‘巨峰’的初代培养基萌芽率达到71.1%，MS 培养基添加0.2 mg/L 3-吲哚丁酸（IBA）、1.0 mg/L 6-BA 和0.5 mg/L KT 启动培养酿酒葡萄茎段外植体，萌芽率达73%以上，圆叶葡萄品种在仅加入6-BA 1 mg/L 的MS 培养基中，茎段增殖效率高,植株生长良好[8-9]。‘甜蜜蓝宝石’是一个新品种，其组织培养尚未见报道，建立其组织培养快速繁育体系，对加快其苗木生产和繁育以及提高苗木质量具有重要意义。本试验以‘甜蜜蓝宝石’葡萄当年生半木质化茎段为外植体，对‘甜蜜蓝宝石’组培技术条件进行筛选，从而获得合适的培养体系，为组培进行快速育苗研究提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 研究对象

以‘甜蜜蓝宝石’葡萄当年生半木质化茎段为试材，取自郴州市农业科学研究所小埠果树基地葡萄温室大棚。

1.1.2 试剂

植物生长调节剂：包含6-BA，国药集团化学试剂有限公司；IBA，上海稼丰园艺用品有限公司；NAA，国药集团化学试剂有限公司。蔗糖、琼脂（BR），国药集团化学试剂有限公司。

1.2 方法

1.2.1 培养基及配制

基本培养基为MS、1/2 MS 及1/4 MS，其中1/2 MS 是将MS 中大量元素成分减半，1/4 MS 是将MS 中大量元素成分减为1/4；所有培养基中均加3%蔗糖和0.65%琼脂，pH 调节至5.80～5.95，高压灭菌条件为压力1.1 kg/cm2，121 ℃保持20 min。

1.2.2 材料消毒

以生长健壮的半木质化茎段为外植体，茎段直径约为0.8 cm，首先用软毛刷蘸取洗洁精轻刷茎段表面，然后在流水下冲洗1 h，再剪成长2～3 cm 带一个腋芽的茎段，置于超净工作台上。先用75%酒精消毒40 s，然后用无菌水清洗2 次，再分别用1%、3%次氯酸钠及0.1%升汞三种试剂消毒，试验设6 个不同的消毒处理，见表1。

表1 不同消毒处理Table 1 Different disinfection treatment

1.2.3 接种

茎段消毒完后再用无菌水反复漂洗5 次，用灭菌的滤纸吸去表面多余水分。然后切去两端褐化的伤口，将消毒过的材料切成长1.0 cm 左右带一个腋芽的茎段，正插于启动培养基上进行培养。启动培养基为1/2 MS，不添加任何激素，每瓶接种1 个茎段，每个处理接种20 个茎段，设3 次重复。设置培养室条件如下：保持温度26 ℃左右，相对湿度为40%～60%，每日光照12 h。15 d 后，统计接种材料的污染率、褐变率和成活率，计算方法分别见公式（1）（2）（3），用以确定最佳的消毒方法。

1.2.4 快繁体系的建立

（1）初代培养

采用筛选出的最佳消毒方法进行消毒，把消毒后的茎段接种于初代培养基上，设置四个配方（分别记作PC1、PC2、PC3、PC4），培养基成分见表2。每瓶接种1 个茎段，每个处理接种30 个茎段，3 次重复。培养条件为保持温度26 ℃左右，相对湿度为40%～60%，每日光照12 h。30 d 后，记录生长情况并统计萌芽率。萌芽率按照公式（4）计算得出。

表2 不同初代培养基配方Table 2 Different formulations of primary mediums

式中，A为萌芽的茎段总数，T为接种的茎段总数。

（2）增殖培养

将初代培养腋芽生长最好的培养基作为筛选出的初代培养基配方，接种50 d 后，当该培养基上腋芽生长至株高4～5 cm 时，将其剪下，去掉叶片，从中剪取健康饱满的处在中间节位的单芽茎段，长度约0.5～1 cm，做到茎段基本一致，然后接种于增殖培养基上，每瓶接种3个茎段，培养基设置5 个配方（分别记作PZ1、PZ2、PZ3、PZ4、PZ5），培养基成分见表3。每个处理接种15 个茎段，设3 次重复，培养条件同初代培养。45 d 后统计萌芽率、平均株高、增殖系数和生长情况。其中增殖系数按照公式（5）计算。

表3 不同增殖培养基配方Table 3 Different formulations of breeding mediums

式中，B为可用于下次继代的茎段总数，W为接种的茎段总数。

（3）生根培养

增殖培养45 d 后，将腋芽生长最好的培养基作为筛选出的增殖培养基配方，将其中生长的腋芽剪下，去掉叶片，从中剪取健康饱满的中间节位的单芽茎段，长度0.5～1 cm，做到茎段基本一致，接种于生根培养基，培养基设置5 个配方（分别记作PT1、PT2、PT3、PT4、PT5），培养基成分见表4。每瓶接种5 个茎段，每个处理接种20个茎段，设3 次重复，培养条件与增殖培养条件一致。50 d后观察生长情况，统计萌芽率、生根率、主根密度及平均根长。其中生根率按照公式（6）计算得出。

表4 不同生根培养基配方Table 4 Different formulations of rooting mediums

式中，C为生根的茎段总数，W为接种的茎段总数。

（4）炼苗和移栽

生根培养50 d 以上，当生根良好的组培苗株高达到5～7 cm、带5～7 个叶片时，将试管苗置于炼苗室，先拧松瓶盖炼苗2～3 d，再完全打开瓶口炼苗7～10 d，待茎秆颜色加深，叶片发亮时即可出瓶移栽，将植株小心取出，用自来水洗净组培苗根部的培养基，准备配制好的基质（含椰糠、草炭土、珍珠岩和蛭石四种成分，比例为2∶1∶1∶1），用多菌灵溶液搅拌至基质土坨不散，分装至营养钵（直径约6.5 cm），然后移栽组培苗。将苗子置于育苗箱中，盖上盖子保湿，然后保持温度在25 ℃左右，注意通风，防止基质发霉，当出现新生叶1～2 片时，打开盖子通风2 d，将苗再次转入营养袋，观察成活情况。

1.3 统计分析方法

采用Excel 2007 软件和SPSS 22.0 软件进行数据处理及分析。

2 结果与分析

2.1 外植体最佳消毒方法

用次氯酸钠消毒后，外植体易出现褐化现象，且影响腋芽的萌发，而用升汞消毒则颜色较正常。由表5 可知，0.1%升汞消毒的表现优于1%、3%次氯酸钠，茎段外植体的最佳消毒处理是T6，即0.1%升汞消毒15 min，外植体污染率、褐变率和成活率分别是46.7%、13.3%和40.0%。因此，外植体的消毒方法采用先用75%酒精消毒40 s，再用0.1%升汞消毒15 min。

表5 外植体最佳消毒方法的筛选Table 5 Selection of the best method for disinfection of explants

2.2 不同初代培养基对茎段诱导的影响

茎段外植体接种到不同初代培养基上，30 d 后统计茎段外植体萌芽率（见表6）。结果表明，外植体在四种培养基配方上都有萌芽，但是在不添加任何激素的1/2 MS上的表现最好，萌芽率达到57.8%，新芽生长正常；以1/2 MS 为基本培养基的另两个配方，其中添加了6-BA 和IBA 两种激素，茎段基部产生较多愈伤组织，且新芽生长不正常，后期出现玻璃化现象；在不添加任何激素的MS培养基上，茎段基部膨大明显，影响腋芽的生长，导致出芽慢且有玻璃化现象。所以确定最佳初代培养基配方为1/2 MS+30 g/L 蔗糖+6.5 g/L 琼脂。

表6 不同初代培养基茎段诱导情况Table 6 Stem segment induction in different primary mediums

2.3 不同增殖培养基对茎段培养的影响

增殖培养过程中，5 种培养基上的茎段生长表现各不相同，第45 天统计情况，结果见表7。以不添加任何激素的1/2 MS 增殖效果最好，增殖系数高达5.2，显著高于其他处理，基本不产生愈伤，生长正常，还能同时生根；在PZ1、PZ2 和PZ3 三种培养基上，茎段基部愈伤率都达到100%，随着6-BA 浓度的提高，萌芽率逐渐升高，但是愈伤组织越来越大，新芽叶片短小、节间短缩，且部分出现丛生芽及玻璃化的现象；PZ4 中生长激素用NAA 替换IBA，但是其产生的愈伤组织更大，叶片小且偏黄，新芽生长不正常，说明该配方不合适。

表7 不同增殖培养基的培养效果Table 7 Culture effect of different propagation medium

2.4 不同生根培养基对葡萄生根的影响

生根培养50 d 后，随机选取10 株苗进行统计，结果见表8（见下页）。‘甜蜜蓝宝石’葡萄品种容易生根，不添加任何激素的1/2 MS 培养基生根率也很高，但是新梢茎秆纤细，不利于移栽。添加不同浓度的生长素后均有生根，其中1/4 MS 培养基中添加IBA 浓度为0.1 mg/L 时，即培养基PT1 效果最好，萌芽率达到91.7%，生根率达到88.3%，生长正常，随着IBA 浓度逐渐提高，虽然新梢茎秆更加粗壮，但基部产生的愈伤更多，导致萌芽率及生根率逐渐降低，新梢生长过慢。而添加0.5 mg/L 的NAA，则出现部分只长根不萌芽的现象，萌芽率只有30%，生根率只有55%，且根为气生根，愈伤组织大而疏松。

表8 不同生根培养基的培养效果Table 8 Culture effect of different rooting medium

2.5 炼苗移栽情况

试管苗驯化时，保持温度20～28 ℃，湿度在80%左右，让试管苗逐渐适应外界的环境，不能操之过急。本试验采用配制好的基质土用于幼苗的驯化，再次移栽至营养袋时，已经产生较多新根，在营养袋生长两周后，统计成活率高达90%。

3 讨论

外植体消毒作为组织培养的第一步，具有关键作用，外植体的生长发育情况及对其消毒时间的长短，对发芽率尤为重要，因此寻求最佳的消毒药剂及其浓度和时间的组合，控制外植体污染和褐变率，是消毒环节的重要问题[10-11]。本试验筛选出了较优的消毒方法，但外植体污染率太高，萌芽率过低，可能因为取材于野外的环境，且取材季节过晚，雨季天气来临，病菌种类多变且繁殖活跃[12]，导致难以消毒。虽然通过延长消毒时间可以降低部分污染率，但同时也增加了死亡率，最终萌芽率也不高。所以进一步探索合适的取材时间很有必要。

植物激素具有刺激形成层细胞的分裂、诱导愈伤组织、不定芽和不定根的形成等生理作用，缺乏或者过多都会对植物生长产生不利影响[7]。植物组织培养增殖过程中，可以通过腋芽产生不定芽（丛生芽）和腋芽萌发成新梢两种方式扩繁，生长素类物质在两种方式中均是必需的，而细胞分裂素类物质在促发丛生芽的方式中是必需的，但在腋芽萌发成新梢的过程中不是必需的[13-15]。但本试验增殖培养过程，在添加了激素的培养基中，因为基部产生较多愈伤，抑制了发根和抽茎，芽的生长受到抑制，生长缓慢；或者部分产生了丛生芽，但是难以继续生长，并出现玻璃化现象，所以选择不添加任何激素的1/2 MS 基本培养基作为增殖培养基，以腋芽萌发成新梢的方式进行扩繁，不产生丛生芽，继代增殖系数相对较低，但组培苗生长健壮，多次继代培养后无玻璃化、褐化现象[16-17]；生根培养过程中，随着添加IBA 浓度的逐步升高，基部产生的愈伤也不断增多，导致萌芽率及生根率逐渐降低，新梢生长减缓，但是在不添加生长激素的培养基中，新梢茎秆纤细，不利于移栽，所以选择添加0.1 mg/L的IBA 进行生根培养最合适，这说明一定浓度的外源生长素如IBA、IAA 可促进葡萄根的发育和试管苗生长，但浓度过高诱导产生大量愈伤组织，则会抑制试管苗的生长[18-21]，与大部分研究一致。

营养物质对组培苗的生长状况影响很大[20]。虽然本试验中茎段可以一次成苗，一次成苗即将继代培养和生根培养同时进行，既能加快试管苗的培育速度，又能减少劳动力的消耗，具有很大优势，但因为采用增殖培养基配方同步生根的苗子茎秆过于纤细，不利于炼苗移栽；而采用生根培养基配方一次成苗，则增殖太慢，因为生根培养后的瓶苗茎秆过于老化，难以再增殖。而用两次成苗法，即用增殖培养基先增殖，然后再转接到生根培养基上进行生根培养，则起到了壮苗的作用，能有效提高移栽的成活率，且培养基大量元素的用量减半，在生产上更有成本优势。所以本试验增殖和生根分两步完成，这与大部分研究一次成苗的结论不一致[21]，分析原因可能是培养基的配方需要调整，也可以尝试缩短生根培养的时间，及时转接继代，用以提高增殖率，今后仍需进一步探索。

4 结论

‘甜蜜蓝宝石’葡萄的组织培养包括茎段外植体消毒、启动培养、增殖培养、生根培养以及炼苗移栽环节。本研究发现，‘甜蜜蓝宝石’外植体的最佳消毒方法是先采用75%酒精消毒40 s，再用0.1%升汞消毒15 min；最佳初代培养基为1/2 MS＋30 g/L 蔗糖+6.5 g/L 琼脂，萌芽率达到57.8%；1/2 MS 增殖培养效果最好，增殖培养45 d，增殖系数高达5.2；生根培养基以1/4 MS+IBA 0.1 mg/L效果最好，生根培养50 d，生根率达到88.3%，新芽茎秆较为粗壮，生长正常；炼苗时，保持温度20～28 ℃，湿度在80%左右，成活率高达90%。该组培繁殖体系可用于‘甜蜜蓝宝石’葡萄新品种的繁育，有一定的潜在应用前景，为其商业化生产提供了理论参考。