白藜芦醇调控ROS/NLRP3/Caspase1 通路介导的细胞焦亡对重症肺炎大鼠肺损伤的保护作用

卢晶 苑萌 冯学辉 刘佳丽

重症肺炎由普通肺炎发展而来，该病进一步引起肺损伤、呼吸衰竭等一系列并发症，严重影响患者的预后［1⁃2］。目前临床上对重症肺炎的治疗主要以抗菌药物干预为主，虽能减轻机体炎性反应，缓解呼吸困难症状，但临床疗效仍不理想。重症肺炎是一种混合感染的疾病，容易引起引起致病菌耐药性，一旦出现耐药，可能会加快病情的发展，甚至危及患者的生命［3］。白藜芦醇是一种多酚物质，主要存在于葡萄、藜芦、桑葚等植物中，具有广泛的抗炎、抗氧化、免疫调节的作用［4］。相关文献显示，肺损伤可促进机体活性氧簇（reactive oxy⁃gen species，ROS）的产生，ROS 可以通过激活NOD样受体蛋白3（NOD⁃likereceptorthermalproteindo⁃main3，NLRP3）炎症小体，促进机体释放半胱氨酸蛋白酶⁃1（cysteinylaspartatespecificproteinase1，Cas⁃pase⁃1），进而导致细胞焦亡［5］。本研究将建立重症肺炎大鼠模型，探讨白藜芦醇对ROS/NLRP3/Caspase1 通路及其介导的细胞焦亡的影响，探讨其治疗重症肺炎的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物

50只雄性清洁级健康SD 大鼠，购自广东省医学动物实验中心。动物批号：No.44007200026770。适应性饲养一周后进行试验。动物饲养与实验严格按照动物试验伦理进行。

1.1.2 主要实验仪器

光学显微镜（Olympus 公司）、高速冷冻离心机（德国Eppendorf 公司）、血气分析仪（武汉明德生物科技股份有限公司）、全自动生化分析仪（深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司）、石蜡切片机（LEICA 公司）；石蜡包埋机（LEICA 公司）。

1.1.3 主要实验药物及试剂

白藜芦醇、0.9%生理盐水、戊巴比妥、二甲苯、苏木精⁃伊红（HE）染色试剂盒、ROS 试剂盒（上海酶联生物科技有限公司）、NLRP3 抗体、Caspase⁃1抗体、细胞焦亡关键蛋白Gasdermin D 的N 末端片段（GSDMD⁃N）抗体、β 肌动蛋白基因（β⁃actin）抗体（兔多克隆抗体，IgG，稀释度1∶20 000）、蛋白裂解液（RIPA Lysis Buffer，RIPA）。

1.2 方法

1.2.1 建模及分组

40 只SD 大鼠适应性饲养一周后，经气管穿刺0.30 mL 肺炎克雷伯菌液，7 d 后大鼠出现活动和进食明显减少，口鼻分泌物增多，现呼吸困难、喘促、肺部湿啰音等症状时，视为建模成功。10 只SD 大鼠正常饮食喂养5 周后，经腹腔注射生理盐水。将建模成功的40 只SD 大鼠依据随机数字法分为4 组，即模型组、白藜芦醇低剂量组（6.5 mg/kg 灌胃）、中剂量组（13.0 mg/kg 灌胃）、高剂量组（26.0 mg/kg 灌胃）各10 只。

1.2.2 给药方法

白藜芦醇低、中、高剂量组大鼠分别给予6.5 mg/kg、13.0 mg/kg 和26.0 mg/kg 白藜芦醇；给药方式均为灌胃给药，空白组和模型组灌胃生理盐水10 mg/kg，每日1 次，连续灌胃8 周。

1.2.3 标本采集

8 周后，将大鼠麻醉，将大鼠平躺置于动物手术台上，腹部消毒，用剪刀沿着腹中线切开腹腔，露出腹主动脉，用10 mL 的无菌注射器慢慢抽回血液处死大鼠。取大鼠血液15 mL，采用高速冷冻离心机以3 000 r/min 离心10 min（离心半径15 cm），取上清液放于-80℃超低温冰箱。用剪刀沿胸切口，一部分肺组织甲醛中固定，用于HE 染色；一部分用于Western 印迹法检测。

1.2.4 相关生化指标检测方法

取大鼠上清液，采用酶联免疫吸附法检测肺组织中白细胞介素⁃1β（IL⁃1β）、白细胞介素⁃6（IL⁃6）、肿瘤坏死因子⁃α（TNF⁃α）水平。

1.2.5 大鼠肺组织HE 染色

包埋切片。用中性甲醛固定大鼠肺组织24 h 以上，脱水，石蜡包埋，4 μm 连续切片，在60℃下烘烤40 min，脱蜡直至水化。往切片中加入苏木素染色5 min，再用清水冲洗5 min；用1%盐酸乙醇将其浸渍5 s；用伊红溶液浸泡3 min，将其分别放入二甲苯中透明10 min；用中性树脂密封，放在玻片架上，干燥后于显微镜下观察。

1.2.6 蛋白印迹法

取冷冻后的SD 大鼠肺组织，称量后，加入200 μ的LRIPA 将其稀释，提取总蛋白，用二喹啉甲酸法测定蛋白浓度。用50 μg 蛋白行电泳、电膜反应，5%脱脂乳于室温下封闭过夜，再加入一抗［ROS、NLRP3、Caspase1、GSDMD⁃N 以及1∶3 000 的β⁃ac⁃tin 内参］，4℃条件下孵育过夜，洗膜后加入（1∶2 000）二抗再培养2 h，用电化学发光法（Electrochemiluminescence，ECL）荧光显影，观察、拍照，并用Image J 软件对其进行分析检测电泳条带的灰度值。

1.3 统计学分析

采用SPSS 21.0 软件进行统计学分析，计量资料以（）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LDS⁃t 检验，P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组SD 大鼠相关血清因子水平比较

干预治疗8 周后，模型组TNF⁃α、IL⁃6、IL⁃1β、ROS 水平>白藜芦醇低剂量组>白藜芦醇中剂量组>白藜芦醇高剂量组，差异有统计学意义（P<0.05）。见表1。

表1 各组SD 大鼠相关血清因子水平比较（）Table 1 Comparison of Serum Factor Levels in SD Rats（）

表1 各组SD 大鼠相关血清因子水平比较（）Table 1 Comparison of Serum Factor Levels in SD Rats（）

注：与空白组比，aP<0.05；与模型组比，bP<0.05；与低剂量组比，cP<0.05；与中剂量组比，dP<0.05。

2.2 肺组织病理学变化

与空白组SD 大鼠比，模型组SD 大鼠肺组织明显损伤，且有大量炎症细胞浸润；模型组SD 大鼠比，白藜芦醇低、中、高剂量组SD 大鼠肺泡内渗出、炎症细胞浸润等症状均明显改善。见图1。

图1 SD 大鼠肺组织病理学变化（HE，×200）Figure 1 Pathological changes of lung tissue in SD rats（HE，×200）

2.3 各组SD 大鼠肺组织中NLRP3、Caspase1、GSDMD⁃N 蛋白水平比较

干预治疗8 周后，模型组NLRP3、caspase⁃1 和GSDMD⁃N 水平>白藜芦醇低剂量组>白藜芦醇中剂量组>白藜芦醇高剂量组，差异有统计学意义（P<0.05）。见表2、图2。

图2 蛋白印迹图Figure 2 Western blotting map

表2 各组SD 大鼠肺组织中NLRP3、Caspase1、GSDMD⁃N蛋白水平比较（）Table 2 Comparison of NLRP3，Caspase1 and GSDMD⁃N protein levels in lung tissue of SD rats in each group（）

表2 各组SD 大鼠肺组织中NLRP3、Caspase1、GSDMD⁃N蛋白水平比较（）Table 2 Comparison of NLRP3，Caspase1 and GSDMD⁃N protein levels in lung tissue of SD rats in each group（）

注：与空白组比，aP<0.05；与模型组比，bP<0.05；与低剂量组比，cP<0.05；与中剂量组比，dP<0.05。

3 讨论

肺炎是由细菌、病毒感染或病毒和细菌混合感染引起的肺泡、肺间质炎症性疾病，重症肺炎是肺炎进一步恶化而来，重症肺炎患者的机体炎症程度较高，通常还会出现严重的低氧血症、急性呼吸衰竭等临床表现［6⁃7］。

本研究通过构建大鼠重症肺炎模型，观察白藜芦醇对重症肺炎大鼠肺损伤的保护作用以及ROS/NLRP3/Caspase1 通路在其中作用。IL⁃1β 能促进细胞内各种细胞因子的表达，TNF⁃α、IL⁃6 能促进细胞内各种炎症因子的激活，上述炎症指标是细胞焦亡通路的下游作用因子，其在细胞外能聚集炎症细胞，加快炎症反应，加剧肺组织损伤。研究结果发现，干预治疗8 周后，与模型组比较，白藜芦醇各剂量组TNF⁃α、IL⁃6、IL⁃1β、ROS 水平下降；且白藜芦醇剂量越高降低幅度越大。TNF⁃α、IL⁃1β、IL⁃6 是重症肺炎发生的主要炎性因素，其发生与NLRP3 有一定关系。NLRP3 炎症小体在炎症反应级联放大激活中的调控作用已引起人们的注意，NLRP 3 和Caspase 1 是一类模式识别受体，与病原菌结合后在细胞内促使Caspase1 活化，活化的Caspase1 将TNF⁃α、IL⁃1β、IL⁃6 前体分解成促炎生物活性成熟体，从而参与炎症反应的级联放大过程［1］。洪蕾等［8］研究发现，白藜芦醇通过下调炎症因子的表达，减轻机体炎症反应来修复细胞损伤。相关文献报道，白藜芦醇可明显减少大鼠肺组织中IL⁃18、IL⁃1β 水平，并通过抑制NLRP3 的分泌，缓解肺组织的炎症反应［9］。黄艳生等［10］研究显示，海水淹溺大鼠出现的呼吸衰竭情况时使用白藜芦醇的预处理可以快速缓解起症状，改善大鼠的缺氧状态，促进大鼠的康复。干预治疗8 周后，白藜芦醇低、中、高剂量组SD 大鼠肺组织中肺泡内渗出、炎症细胞浸润等症状均比模型组明显改善，提示白藜芦醇能够有效改善病理学病变及肺功能。原因考虑为，在肺损伤疾病中，白藜芦醇对大鼠肺组织保护很可能与抑制炎症反应相关，通过减少小鼠肺内炎性细胞浸润，进而减少肺组织损伤［11］。何琼等［12］研究也证实了，用白藜芦醇预处理的急性肺损伤小鼠肺组织肺损伤更轻。

细胞焦亡是一种依赖于Caspase1 活性的消皮素蛋白介导的细胞凋亡过程，在细胞凋亡过程中中，炎症小体NLRP3 的活化起着至关重要的作用。GSDMD⁃N 是一种有效的炎性小体活化及细胞焦亡的标志物，是真正引起细胞焦亡的功能蛋白，其表达水平增加，可诱发肺组织细胞焦亡，导致肺损伤［13］。研究结果还显示，干预治疗8 周后，相较于模型组，白藜芦醇各剂量组NLRP3、caspase⁃1和GSDMD⁃N 蛋白水平显著下降，白藜芦醇剂量越高下降幅度越大。白藜芦醇能通过抑制NLRP3的氧化反应，减少其氧化损伤，从而控制炎症小体NLRP3、caspase⁃1 的含量［14］。白藜芦醇作为具有抗炎、抗菌、抗炎等多种活性物质，被证实能够对脂多糖所致的肺上皮细胞焦亡起一定保护作用，且白藜芦醇在肺炎模型中同样具有抗炎活性。

综上所述，白藜芦醇可改善重症肺炎大鼠肺损伤，其机制可能与通过下调ROS/NLRP3/Caspase1 信号通路表达水平，抑制炎症因子和细胞焦亡的发生相关。