GADD45A 通过端粒替代延长途径调控骨肉瘤细胞增殖

韩鑫宇，李婷芳，王峰

（天津医科大学基础医学院医学遗传学系，天津 300070）

骨肉瘤是一种起源于类骨质组织，常见于儿童和青少年的恶性骨肿瘤，具有极强的侵袭性并且常常在早期发生转移，主要涉及股骨、胫骨和肱骨[1-2]。端粒延长是肿瘤生长所必需的关键过程，不同于绝大多数肿瘤通过激活端粒酶来维持端粒，以骨肉瘤为代表的10%～15%的人类肿瘤通过端粒延长替代途径（alternative lengthening of telomeres pathway，ALT）来维持端粒。使用ALT 延长端粒的肿瘤细胞具有独特的ALT 相关表型，例如含有端粒DNA 的大型早幼粒细胞白血病体（promyelocyte leukemia，PML），称为ALT 相关PML 小体（ALT-related PML bodies，APBs）以及染色体外端粒DNA 环（C-circle）等[3-4]。

生长停滞和DNA 损伤诱导蛋白45a（GADD45A）定位于细胞核，其水平受周期调控，在G1 期最高而S期显著降低。GADD45A 在细胞应激反应中起重要作用[5-6]。此外还有研究表明，GADD45A 参与了小鼠干细胞端粒DNA 损伤反应[7]。GADD45A 在细胞周期进展和停滞、DNA 修复和表观遗传修饰等多方面的作用与ALT 阳性肿瘤频繁的DNA 损伤等特点高度相关[7-8]。因此本文旨在探讨GADD45A 对骨肉瘤细胞生长、端粒功能和端粒延长替代途径的影响。

1 材料和方法

1.1 实验材料 人骨肉瘤细胞U2OS 为本实验室保存，DMEM 培养基（美国Corning 公司），Opti-MEM培养基、胰蛋白酶（美国Gibco 公司），胎牛血清（乌拉圭Lonsera 公司），ChamQ Mix、逆转录试剂盒、dNTP Mix（南京诺维赞生物科技有限公司），DNA 提取试剂盒（Biomiga 倍沃医学科技有限公司），RNA提取试剂盒（美国Promega 公司），无水乙醇、无水甲醇、异丙醇、冰乙酸（天津康科德生物化工公司），4%多聚甲醛、1 mol/L Tris-HCl（pH7.2）、牛血清白蛋白（BSA）、6×DNA loading buffer（北京索莱宝生物技术公司），国产甲酰胺、秋水仙素（上海生工生物技术股份有限公司），进口甲酰胺、TritonX-100、TWEEN-20、Gelatin from cold water fish（美国Sigma 公司），Blocking Reagent、DIG Easy Hyb Granules、CD-Star Ready-to-use solution、Anti-DIG-AP 抗体（瑞士Roche公司），TelC-FITC PNA 探针488/CY3（韩国Panagene公司），DAPI、Anti-γH2AX 抗体（德国Millipore 公司），Anti-PML 抗体（C-5）（Santa Cruz），Alexa 555 goat anti-Mouse 抗体、Lipofectamine RNAi-Max（美国Thermo 公司），siRNA（苏州吉玛基因有限公司），Phi 29 DNAPolymerase（美国NEB 公司），DNase/RNase free water（天根生化科技有限公司），细胞增殖-毒性检测试剂盒CCK-8（兰杰柯科技有限公司）。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养 将U2OS 细胞接种于10 cm 培养皿中，以DMEM 培养基（含10%胎牛血清）培养于37℃，5%CO2的培养箱中，待细胞密度达70%～80%时进行传代。

1.2.2 siRNA 转染 将U2OS 细胞接种于6 孔板中，待细胞生长至密度为40%时进行转染。取两支离心管加入Opti-MEM 后分别加入siRNA 和Lipofectamine RNAi-Max，震荡混匀后将两管混合，室温静置5 min 后逐滴加入对应细胞中，反应24 h 后弃去转染液每孔加入2 mL 培养基，48 h 后收取细胞用于后续实验。对应siRNA 序列见表1。

表1 目的基因siRNA 序列Tab 1 siRNA sequences of the target gene

1.2.3 稳定敲低细胞系构建 使用pLKO.1 质粒构建shGADD45A 敲低细胞系。shRNA 序列见表2。用293T 细胞对质粒进行包被，吸取过滤病毒上清感染U2OS 细胞构建稳定敲低细胞系。

表2 shRNA 序列Tab 2 Sequence of shRNA

1.2.4 实时荧光定量PCR 收取细胞，试剂盒提取RNA。测量RNA 浓度后根据逆转录试剂盒将1 μg RNA 逆转合成cDNA，稀释5 倍后用于后续实时荧光定量PCR。按照primer F 0.4 μL、primer R 0.4 μL、ChamQ Mix 10 μL、无核酸酶水7.2 μL 的体系按照程序进行扩增（表3）。根据荧光曲线的ct 值用2-ΔΔCt计算siRNA 敲低效率。

表3 PCR 引物序列Tab 3 Primer sequence for PCR

1．2．5 CCK－8 增殖实验 牛鲍汁计数板计数U2OS细胞，96 孔板每孔接种1 000 个细胞，每个处理组设置6 组重复。分别测量转染后第1、3、5、7 天的450 nm 处吸光度值。

1.2.6 克隆形成实验 牛鲍汁计数板计数U2OS 细胞，6 cm 皿接种5 000 个细胞，每3 天换1 次液，第7 天收取培养皿。吸弃培养基并用超纯水润洗，然后加4%组织固定液固定20 min。洗净固定液后加入0．5%结晶紫染液，染色20 min。洗净多余染液，在吸水纸上倒扣沥干水分，拍照保存用于后续分析。

1.2.7 细胞中期分裂相－荧光原位杂交（Metaphase－FISH） 直接接种稳定敲低细胞或将U2OS 接种于6 cm 培养皿，进行siRNA 转染，收取细胞前10 h更换含秋水仙素的DMEM 培养基（秋水仙素∶培养基=1∶100）。细胞沉淀加入PBS 重悬，边震荡边加入10 mL 37℃预热的0．075 mol/L Kcl，37℃水浴孵育30 min，然后加入5 滴预冷固定液（甲醇∶冰乙酸=3∶1），室温静置5 min，900 r/min 离心8 min。吸弃上清液，边震荡边加入10 mL 预冷固定液，室温静置30 min，900 r/min 离心8 min。吸弃上清液，加1 mL 固定液重悬并取50 μL 滴片，静置1 晚。第2 天用4%多聚甲醛固定细胞，脱水后用TelC－FITC PNA 探针CY3 杂交端粒3 h，洗涤封片，－20℃保存用于后续拍摄统计。

1.2.8 免疫荧光－荧光原位杂交（IF－FISH） 将无菌盖玻片放入六孔板中，直接接种稳定敲低细胞或接种U2OS 细胞并进行siRNA 转染。收取盖玻片洗涤固定，脱水后用TelC－FITC PNA 探针488 杂交端粒3 h，PBG 封闭1 h（PBS∶BSA∶Gelatin=1∶1∶100），加入一抗室温孵育1 h（PML∶PBG=1∶1 000，γH2AX∶PBG=1∶1 000），洗涤后二抗室温孵育30 min（Alexa 555 goat anti－Mouse∶PBG=1∶1 000），DAPI 封片，荧光显微镜拍摄并进行统计。

1.2.9 C－circle 实验 收取细胞提取DNA，测浓度后稀释至30 ng/μL 并按DNA template 1 μL、BSA 0．4 μL、dNTP Mix 2 μL、Phi 29 DNA Polymerase 0．5 μL、Phi 29 buffer 0．4 μL、无核酸酶水14．1 μL的体系进行PCR 反应扩增，反应程序为30℃，8 h；65℃，20 min。将扩增产物进行斑点杂交，紫外交联固定后杂交过夜。第2 天回收杂交液并洗膜、封闭，孵育DIG 抗体8～10 h。孵育结束后洗膜最后用CDStar 显色液曝光。

1.3 统计学处理 采用GraphPad Prism6 和Image J 软件进行统计学分析和作图，所有实验数据为重复3 次实验结果。统计结果采用t 检验，P＜0．05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 GADD45A 对骨肉瘤细胞生长增殖的影响 实时荧光定量PCR 检测siRNA 和shRNA 对GADD45A的敲低效率。与对照组相比，siRNA 敲低GADD45A后mRNA 水平显著降低（t=25．96，P＜0．000 1）；与shscramble 组相比，shGADD45A－1 和shGADD45A－2两细胞系GADD45A 的mRNA 水平下降（t=21．12、18．37，均P＜0．000 1）（图1）。CCK－8 增殖实验结果表明，在siRNA 敲低GADD45A 后或稳定敲低细胞系shGADD45A－1 和shGADD45A－2 中，与对照组相比，骨肉瘤细胞存活率明显下降（t=5．051、6．192、3．775、14．86、22．93、3．013、14．61、20．93，均P＜0．05）（图2A、2B）。克隆形成实验结果表明，在siRNA 敲低GADD45A 后以及shGADD45A－1 和shGADD45A－2两组稳定敲低细胞系中，骨肉瘤细胞增殖能力受到明显抑制，克隆形成减少（t=46．68、23．73、24．98，均P＜0．000 1），见图2C～2D。

图1 实时荧光定量PCR 检测GADD45A mRNA 水平Fig 1 Expression of GADD45A mRNA detected by real-time fluorescence quantitative PCR

图2 GADD45A 对骨肉瘤细胞增殖的影响Fig 2 The effect of GAD45A on the proliferation of osteosarcoma cells

2.2 GADD45A 对骨肉瘤端粒功能的影响 细胞中期分裂相－荧光原位杂交实验显示，siRNA 敲低GADD45A 与shGADD45A－1 和shGADD45A－2 稳定敲低处理后结果相同，染色体末端多端粒信号（Multiple Telomere Signals，MTSs）比例明显升高（t=24．04、7．243、27．93，均P＜0．01），端粒信号丢失（Telomere Signal Free Ends，SFEs）频率也相应增加（t=8．222、16．61、6．781，均P＜0．01）（图3）。

图3 GADD45A 对骨肉瘤细胞端粒功能的影响Fig 3 The effect of GADD45A on the telomere function of osteosarcoma cells

2．3 GADD45A 对骨肉瘤端粒损伤造成的影响 免疫荧光－荧光原位杂交实验结果显示，在使用siRNA敲低GADD45A 和shGADD45A－1、shGADD45A－2 两细胞系中，DNA 损伤指标γ－H2AX 与端粒共定位均上调（t=19．16、14．71、24．03，均P＜0．000 1）（图4）。

图4 GADD45A 对骨肉瘤端粒损伤造成的影响Fig 4 The effect of GADD45A on the telomere damage of osteosarcoma cells

2.4 GADD45A 对骨肉瘤细胞ALT 活性的影响 C－circle 实验结果表明，使用siRNA 敲低GADD45A 时，骨肉瘤细胞中C－circle 水平明显上升（t=41．27，P＜0．000 1）（图5A）。采用shGADD45A－1 和shGADD45A－2 两细胞系也显示C－circle 水平升高（t=14．06、4．539，均P＜0．05）（图5B）。另一方面，通过免疫荧光－荧光原位杂交实验，siRNA 和shRNA 的处理均导致PML 与端粒共定位显著增多（t=10．65、16．69、18．10，均P＜0．000 1），见图5C～5D。

图5 GADD45A 对骨肉瘤细胞ALT 活性的影响Fig 5 The effect of GADD45A on the ALT activity of osteosarcoma cells

3 讨论

本研究发现敲低GADD45A 后抑制了骨肉瘤细胞的增殖，导致骨肉瘤细胞存活率下降。而端粒延长是肿瘤细胞维持增殖所必需的关键特征[9]。与端粒酶阳性肿瘤不同，ALT 阳性肿瘤端粒存在频繁的DNA损伤。并且已有文献报道GADD45A 参与了造血干细胞的DNA 损伤反应[10]。因此，本文通过H2AX 组蛋白变体（γ－H2AX）与端粒的定位来表征端粒损伤信号，首次发现敲低GADD45A 会引起骨肉瘤端粒损伤加剧。另一方面，本研究首次发现敲低GADD45A 会引起骨肉瘤细胞MTS 和SFE 显著升高，表明GADD45A缺失会导致骨肉瘤端粒功能紊乱和复制性衰老并且引起端粒不稳定，加重脆性端粒的产生。

目前已有的研究表明，在间充质来源的肿瘤中，如中枢神经系统肿瘤和多种亚型的肉瘤，往往存在更高比例、更高水平的ALT 表型，这之中又以骨肉瘤最为突出[11]。APBs 是由早幼粒细胞白血病体（PML）、成簇聚集的端粒和一系列与DNA 复制、重组等功能相关的蛋白形成的复合体，是ALT 途径延长端粒的场所。PML 是ALT 细胞形成APBs 并进一步维持端粒长度，造成端粒长度异质性的必要组分[12]。为了探究GADD45A 对ALT 的影响，笔者通过免疫荧光观察PML 与端粒的共定位，发现在敲低GADD45A后，PML 与端粒的共定位明显增多，说明GADD45A抑制了端粒到PML 的聚集，在ALT 途径中发挥了负向调控作用。除此之外，C－circle 作为ALT 阳性肿瘤中的一种特异性且可定量的指标，可以更清晰地反映ALT 活性的变化。C－circle 是染色体外的CCCTAA 重复序列，来自于端粒的后随链，与端粒TTAGGG 重复序列相对应[4]。本研究首次发现在敲低GADD45A 后，C－circle 水平显著升高，与前面结果一致，说明GADD45A 抑制骨肉瘤细胞C－circle形成，限制了ALT 途径发生。有文献报道，ALT 途径的过度激活会抑制ALT 细胞的生长[13-14]。本研究结果发现，敲低GADD45A 后，ALT 表型明显增加，ALT 活性增加，细胞增殖受到抑制，有可能是因为GADD45A 的缺失导致ALT 被过度激活，这也会导致ALT 细胞的死亡。

目前研究认为，ALT 是一种以类似于同源重组的断裂诱导复制（BIR）的方式进行端粒延长的途径[15]。在端粒DNA 损伤断裂后会激活RFC-PCNAPol δ 轴来促进APB 的组装，开始后续RAD52 依赖和不依赖的两种BIR 通路，整个过程还涉及BRCA1、RAD51 等多个同源重组相关蛋白[16-18]。本文已经证实GADD45A 确实参与了骨肉瘤的ALT 进程，结合以往文献报道GADD45A 与PCNA 存在相互作用，提示其可能影响了DNA 损伤反应进而抑制骨肉瘤ALT 活性[19]。此外，已有研究表明GADD45A 可以与R-loop 结合介导CpG 岛的局部去甲基化[20]。亚端粒区丰富的CG 含量提示这一过程在亚端粒位置同样有可能实现[21]。GADD45A 介导的去甲基化过程可能抑制端粒区的异染色质化，使染色质收缩，从而阻碍ALT 相关蛋白与端粒的结合。这与过往研究中提到的ALT 端粒处松弛的染色质结构这一特点有所呼应[22]。另一方面，笔者推测GADD45A 与BRCA1的相互作用也有助于GADD45A 与R-loop 的结合，R-loop 进一步刺激同源重组过程也是引起ALT 相关表型变化的原因[19，23]，后续笔者会对GADD45A 如何调控ALT 进行深入的探究。

综上所述，GADD45A 缺失能够抑制骨肉瘤增殖，并通过参与骨肉瘤ALT 径影响端粒功能，造成端粒功能紊乱，加剧端粒DNA 损伤。