氮掺杂碳量子点电化学发光检测谷胱甘肽

刘祥苗　刘婷　杨敏丽

摘要：碳量子点（CQDs）以其优良的光电性能，以及环保、价廉、易得的优点而受到极大关注.以柠檬酸（CA ）和三聚氰胺（Melamine）为原料，采用一步水热法成功制备了氮掺杂的碳量子点（ N-CQDs）.对其形貌、组成及光谱性能进行了表征，详细研究了其电化学发光（ECL ）性能，结果表明：所合成的 N-CQDs 在共反应剂过硫酸钾（K2S2 O8）存在下能发射强且稳定的 ECL 信号.进一步研究显示：金纳米粒子（Au NPs ）的存在会导致 N-CQDs 的 ECL 信号猝灭，而谷胱甘肽（GSH ）的加入又能使其 ECL 信号得以恢复.根据这一特点实现了对 GSH 的灵敏检测，线性响应范围为1.0×10-9～1.0×10-4 mol ·L-1，检出限是8.0×10-10 mol ·L-1.该策略也可用于其他含巯基（-SH ）的生物硫醇类物质的检测.

关键词：电化学发光（ECL ）；氮掺杂碳量子点（N-CQDs）；谷胱甘肽（GSH ）；金纳米粒子（Au NPs）

中图分类号：O 657.1   文献标志码：A   文章编号：1000-5137（2023）01-0038-08

Determination of glutathione based on electrochemiluminescence of N-CQDs

LIU  Xiangmiao，LIU Ting，YANG  Minli*

（College of Chemistry and Materials Science，Shanghai Normal University，Shanghai 200234，China）

Abstract：Carbon quantum dots（CQDs）have attracted great attention because of their excellent photoelectric properties，environmental friendliness，low cost，and easy availability. Nitrogen doped carbon quantum dots（N-CQDs）were prepared by one-step hydrothermal method using melamine and citric acid（CA） as raw materials. Their morphology，composition，and spectral properties were characterized with various technologies. The electrochemical luminescence（ECL） property of N-CQDs was investigated in detail. The result showed that the synthesized N-CQDs could emit strong and stable ECL signals in the presence of co-reactive potassium persulfate（K2S2O8）. Further studies showed that the presence of gold nanoparticles（Au NPs）could cause the ECL signal of N-CQDs to be quenched，and the addition of glutathione（GSH） could restore the ECL signal. Based on this principle，the sensitive detection of GSH was achieved with a linear response range of 1.0×10-9 to 1.0×10-4 mol ·L-1 and a detection limit of 8.0×10-10 mol ·L-1. This strategy can also be usedfor the detection of other mercapto（-SH ） containing biothiols.

Key words：electrochemiluminescence（ECL）；nitrogen-doped carbon quantum dots（N-CQDs）；glutathione（GSH）；gold nanoparticles （ Au NPs ）

谷胱甘肽（GSH ）作為一种内源性抗氧化剂在许多生理过程中发挥着重要作用，例如抗衰老、抗自由基、减少过氧化物和重金属造成的损伤[1-4].研究表明，GSH 平衡的破坏与各种神经系统疾病有关，例如阿尔茨海默病（AD ）、多发性硬化症（MS ）和帕金森病（PD ）[5-7].因此，GSH 的检测具有重要的临床意义.迄今为止，已经提出了多种检测 GSH 的方法，包括比色法（CA ）[8]、分光光度法（SP ）[9]、荧光光谱法（FL ）[10]和表面增强拉曼散射法（SERS ）[11]等.然而，前两种检测方法的灵敏度低，不能满足低浓度 GSH 测定的需求，而后两种方法需要昂贵的仪器，且背景信号强.电化学发光（ECL ）法是一种通过电极激发产生化学发光的分析方法，具有仪器简单、灵敏度高和背景信号低的优点，目前已成为食品、环境监测和生物分析等领域中必不可少的分析手段[12-13].

碳量子点（CQDs）是直径小于10 nm 的经典零维材料，它们具备合成简单、成本低、生物相容性好以及环境友好等特点[14].近年来，有关 CQDs 的 ECL 研究引起了人们的广泛关注[15].但是，单纯的 CQDs 存在发光效率较低、分析选择性不佳等问题，需要通过掺杂或表面修饰来改善其发光性能和分析选择性.氮（ N ）与碳（C ）的物理和化学性能接近，易掺杂进 CQDs 中.N 元素的掺杂能提高 CQDs 的 ECL 强度和稳定性[16]，同时，N 掺杂在 CQDs 表面引入了-NH2，可通过表面-NH2的功能化反应选择性检测更多物质[17].

本研究以柠檬酸（CA ）和三聚氰胺（Melamine）为原料，利用一步水热法成功合成了具有良好 ECL 性能的氮掺杂碳量子点（N-CQDs）.将其固定在玻碳电极（GCE ）上，在0～-2.0 V 电位扫描下产生强的ECL 信号，金纳米粒子（Au NPs ）的加入会和 N-CQDs 发生能量转移（ET ），从而熄灭其 ECL 信号，而 GSH 又能使其 ECL 信号得以恢复，利用这个特点，实现了 GSH 的快速灵敏检测.

1 实验部分

1.1 实验试剂

三聚氰胺、过硫酸钾（K2S2O8）均购于阿拉丁（上海）有限公司；CA、壳聚糖（CHIT，脱乙酰度98%）均购于美国 Sigma-Aldrich 化学公司；四水氯金酸（HAuCl4·4H2O ）、尿素（Urea ）、抗坏血酸（AA ）、乙酸、无水乙醇均购于国药集团化学试剂有限公司；柠檬酸三钠购于江苏强盛化工有限公司；还原型 GSH 购于Sangon Biotech；L-半胱氨酸（L-Cys）、L-酪氨酸（L-Tyr）、L-赖氨酸（L-Lys）、葡萄糖（Glu）、L-色氨酸（ L-Trp）、氯化钾、盐酸、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠均购于上海 Adamas 试剂公司；氢氧化钠购于天津市广成化学试剂有限公司；所有药品均为分析纯，溶液以超纯水配置.

1.2 实验仪器

电化学工作站（CHI 660E），上海辰华仪器有限公司；ECL 分析系统（MPI-A/B ），西安瑞迈分析仪器有限责任公司；透射电子显微镜（TEM，JEM-2010），日本电子公司；紫外分光光度计（UV-1800）和荧光分光光度计（RF-5301PC），日本岛津公司；傅里叶变换红外光谱仪（FT-IR，Nicolet iS5），Thermo Scientific 公司；X 射线光电子能谱仪（XPS，ULVCA-PHI ），美国 PE 公司.

1.3  N-CQDs 的制备

以 CA 作为 C 源，三聚氰胺作为 N 源，参考文献[18]的方法，合成 N-CQDs.具体步骤为：1）称取0.200 g CA 和0.083 g 三聚氰胺溶于6 mL 去离子水中，超声30 min，将混合液转移至50 mL 反应釜内，密封加热到160℃，持续12 h；2）反应结束后，自然冷却至室温，然后以8000 r ·min-1速度离心10 min，取上清液于截留分子质量（MWCO ）为1000 u 的透析袋内透析14 h，去除未反应的 CA 与三聚氰胺，得到 N-CQDs，用于后续实验.

1.4  Au NPs 的制备

采用柠檬酸三钠还原 HAuCl4·4H2O 的方法制备 Au NPs[19]：1）量取250μL 物质的量浓度为0.1 mol ·L-1的HAuCl4·4H2O 加入到装有100 mL 去离子水的锥形瓶中，然后将其置于磁力搅拌器上，加热至微沸状态；2）在锥形瓶中滴加800μL （质量分数为1%）的柠檬酸三钠.数分钟后观察到溶液颜色变为紫红色（淡黄色→无色→紫红色），在535 nm 处观察可到 Au NPs 的最大紫外可见吸收（UV-vis）峰.

1.5  N-CQDs 与CHIT 混合液（N-CQDs/CHIT）的制备

首先配置质量分数为1.0%的 CHIT 乙酸溶液：称取0.1 g 的 CHIT 溶解在10 mL 的乙酸溶液（质量分数为0.5%）中，得到1.0%（质量分数）的 CHIT 乙酸溶液.然后，取3 mL N-CQDs 与1 mL CHIT 乙酸溶液混合，超声1 min，即得 N-CQDs/CHIT 混合液.

1.6  N-CQDs 与CHIT 混合液传感器（N-CQDs/CHIT/GCE）的制备

将 GCE（直径Φ=3 mm）用0.5μm 的氧化铝（Al2O3）打磨至光滑，然后用蒸馏水冲洗，再用乙醇与蒸馏水（体积比为1∶1）混合液超声处理1 min，用蒸馏水冲洗，自然晾干.取6.0μL N-CQDs/CHIT 混合液滴涂在经过上述处理后的 GCE 表面，自然晾干，得到 N-CQDs/CHIT/GCE 传感器，如图1所示.

1.7  ECL 检测方法

利用三电极系统，工作电极为 GCE 电极，对电极为铂（Pt ）丝电极，参比电极为氯化银电极（Ag/AgCl）电极.检测底液：含0.14 mol ·L-1 K2S2O8的0.1 mol ·L-1磷酸盐缓冲溶液（PBS ）（pH=7.4）.在0～-2.0 V 的范围内以100 mV·s-1扫描速率扫描（光电倍增管电压为800 V，扫描方向为负扫，起始电位为0 V），记录 ECL 信号.实际检测时，将检测物质加入到底液中，检测 ECL 信号.

2 结果与讨论

2.1  N-CQDs 的合成条件优化

分别以 CA、CA+三聚氰胺、CA+尿素为原料，采用一步水热法合成不掺杂的 CQDs 和2种 N-CQDs，比较三者的 ECL 信號.结果显示：N-CQDs 的 ECL 明显高于不掺杂的 CQDs 的，证明 N 掺杂可以改善 CQDs 的 ECL 发光效率.而相对尿素，以三聚氰胺作为 N 源获得的 CQDs 发光效率更高，因此选择 CA 和三聚氰胺作为原料合成的 N-CQDs.为了获得 ECL 性能更好的 N-CQDs，对 CA 和三聚氰胺的比例、反应温度、反应时间，以及透析时间进行了优化，最终选择 CA 和三聚氰胺的物质的量之比为2.5∶1.0，在160℃下反应12 h，透析时间为14 h.

2.2  N-CQDs 的形貌表征

图2（a）为 N-CQDs 的 TEM 图，N-CQDs 呈现出类球状结构.图2（b）为 N-CQDs 的粒径分布图，通过计算软件统计，得到 N-CQDs 的平均粒径为（1.5±0.8） nm.

2.3  N-CQDs 的光谱表征和XPS 表征

图3是 N-CQDs 的相关光谱图和 XPS 谱图.从图3（a）的紫外吸收谱图可以看出，232 nm 处有一个明显的特征吸收峰，这归因于 C ＝C 的π-π*跃迁，在252～300 nm 之间有一个弱吸收带，这与 C ＝O，C ＝N 键的 n-π*跃迁有关，此结果与文献报道的结果吻合[20].图3（b）为 N-CQDs 处于不同激发波长下的荧光发射谱图，可以看出 N-CQDs 的发射波长随着激发波长从300 nm 增加至360nm 而呈现逐渐红移的现象，其最大荧光发射强度呈现出先增大后减小的趋势，这是一种典型的激发依赖性荧光现象，证明 N-CQDs 的合成成功[21]，并且由图3（b）可以看出 N-CQDs 的最佳激发波长为320 nm.图3（c）是 N-CQDs 的红外谱图，可以看出，出现在3238 cm-1和3410 cm-1的吸收峰是由于 O-H 和 N-H 的伸缩振动，在1725 cm-1处的吸收峰是由于 C ＝O 的伸缩振动，1576 cm-1处的吸收峰归因于 N-H 的变形振动，1420 cm-1和1576 cm-1处的吸收带归属于1，3，5-s-三嗪环（三聚氰胺残留物）[22].在1206 cm-1处的吸收峰是由于 C ＝N 的伸缩振动[22].与 CQDs 的红外谱图相比，N-CQDs 的红外谱图中出现了 C ＝N、1，3，5-s-三嗪环以及 N-H 的特征吸收峰，此结果与文献报道的结果吻合[22].这些含 N 官能团吸收峰的出现，以及 UV-vis、荧光的表征，共同证明了 N 的成功掺杂以及 N-CQDs 成功合成.

用 XPS 对 N-CQDs 的表面组成进行分析，结果如图3（d）～3（f）所示.从图3（d）的全谱图可以看出，表面组成含有碳（C 1s，286 eV）、氧（O 1s，531 eV ）和氮（N 1s，398 eV）3种元素，证明 N 的成功掺杂.N-CQDs 的高分辨率 N 1s 谱图在398.0，398.6和399.4 eV 处有3个峰，分别属于 C—N— C、N—（ C ）3和 N—H 键，如图3（e）所示.图3（f）为 N-CQDs 的高分辨率 C 1s 谱图，经分析，几个特征峰归属如下：284.3 eV（sp2 C ），285.1 eV （sp3 C ），286.8 eV （ C—N ），287.5 eV （ C— O ）和288.7 eV （ C ＝N/C ＝O ），XPS 的结果与红外的结果一致.

2.4 传感器的表征

利用循环伏安法（CV ）、电化学阻抗谱（EIS ）、ECL 这3个方法对传感器进行了表征，如图4所示.图4（a）为传感器在5 mmol·L-1铁氰化钾溶液（[Fe （ CN ）6]3-/4-）（含0.1 mol ·L-1氯化钾（KCl））中的 CV 图，N- CQDs/CHIT/GCE 的氧化还原峰电流明显大于裸 GCE 的电流强度，这是因为 N-CQDs 本身具有良好的导电性，另外，CHIT 表面带正电荷，能吸引更多带负电荷的 Fe（ CN ）6]3-/4-到电极表面参与反应，这一结果证明 N-CQDs/CHIT 被成功修饰到电极上.2种电极对应的 EIS 图如图4（b）所示，与 CV 结果吻合.图4（c）是2种电极对应的 ECL 信号，与裸 GCE 相比，N-CQDs/CHIT/GCE 表现出很强的 ECL 响应，表明 N-CQDs 具有良好的 ECL 活性，而且被成功修饰到电极上.

2.5 实验条件优化

为了获得最佳响应信号，对 K2S2 O8的物质的量浓度、N-CQDs/CHIT 的用量、PBS 的 pH 值、电位扫描速率，以及 Au NPs 的用量进行了优化.最终选择 K2S2 O8的物质的量浓度为0.14 mol ·L-1，N-CQDs/CHIT 的滴涂用量为6μL，底液 PBS 的最佳 pH 值为7.4，扫速为100 mV·s-1，以及 Au NPs 的最佳用量为30μL.

2.6 传感器对 GSH 的 ECL 响应

在优化的实验条件下，测试了传感器对 GSH 的响应，如图5所示，ECL 信号随 GSH 浓度的增大而增强，在1.0×10-9～1.0×10-4 mol ·L-1浓度范围内，ECL 信号增加值与 GSH 浓度对数值呈现线性关系，线性方程为：ΔI=948.9 lg C+13539.8（ΔI=I-I0，其中 I0表示加入 GSH 前传感器的 ECL 强度，I 表示加入 GSH 之后传感器的 ECL 强度，C 表示 GSH 的物质的量浓度），检出限为8.0×10-10 mol ·L-1（检出限的计算公式为3σ/S，其中σ是10次平行空白测量得到的标准偏差，S 是校准曲线的斜率），线性相关数 R2为0.999.将本工作提出的策略与以往报道的策略进行比较（表1），可以发现本方法拥有较低的检出限和更宽的线性范围.

2.7 机理探究

图6是 N-CQDs 的 ECL 光譜（曲线1）、Au NPs （曲线2）和 Au NPs+GSH（曲线3）的 UV-vis 谱图，可以看出，N-CQDs 的 ECL 光谱和 Au NPs 的 UV-vis 谱图有很大重叠，说明两者之间可以发生能量转移.Au NPs 可以通过 Au-N 键结合在 N-CQDs 表面，大大缩短了两者之间的距离，两者之间可以产生能量转移，导致 N-CQDs 的 ECL 信号猝灭.当加入 GSH 后，GSH 中的巯基（-SH ）与 Au NPs 结合能力更强，将 Au NPs 带离 N-CQDs 表面，两者之间的距离增大，能量转移难以实现.同时，Au NPs 与 GSH 结合后，其吸收峰红移，与 N-CQDs 的 ECL 光谱的重叠部分相应减少，能量转移进一步降低，N-CQDs 的 ECL 信号基本得以完全恢复.

2.8 传感器选择性、稳定性与重现性考察

选择性：在相同的条件下测试传感器对 GSH（1.0×10-7 mol ·L-1）及其他物质，包括 L-Cys，L-Lys， L-Tyr，L-Trp，AA 和 Glu 的 ECL 响应（1.0×10-5 mol ·L-1），该传感器对 GSH 的响应最强，对含-SH 的 L-Cys也有响应，而对其他不含-SH 的物质几乎没有响应.进一步证明了其响应机理是基于-SH 与 Au NPs 的结合.

稳定性：在0～-2.0 V 的范围内连续循环扫描15圈，其 ECL 信号无明显变化.此外，传感器在室温下保存，每5 d 作为一周期，连续测试6个周期，其 ECL 信号保持在其原始值的90%以上.

重现性：选7根电极，同样条件下进行修饰，测其 ECL 信号.7个独立电极 ECL 信号的相对标准偏差（ RSD ）为1.90%.

上述结果表明，本工作制备的传感器具有良好的选择性、稳定性和重现性.

3 结论

以 CA 和三聚氰胺为原料，利用一步水热法合成了 N-CQDs，N 元素的掺杂提高了 CQDs 的 ECL 强度和稳定性，利用 Au NPs 能猝灭 N-CQDs 的 ECL 信號，而 GSH加入后信号又得以恢复的特点，实现了对 GSH 的灵敏检测，该方法显示出高的灵敏度和良好的选择性.同时，该策略也可用于其他含-SH 的生物硫醇类物质的检测.

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