多重荧光定量PCR试剂盒在食物中毒病原菌检测中的应用

刘水 孙建飞

摘要：目的 探讨多重荧光定量PCR试剂盒在食物中毒病原菌检测中的应用效果，为食物中毒患者争取治疗时间，确保饮食安全。方法 选取2020年5月～2022年5月期间在本市怀柔区疾病预防控制中心进行食物中毒病原菌检测的54例患者为对象，对其提供的呕吐物、粪便等60份样本进行病原菌检验，通过对主要致病菌研究，建立PCR检测体系，分析与比较常规聚合酶链式反应（PCR）与多重荧光定量PCR试剂盒在食物中毒中检测应用价值。结果 检出54例患者为食源性食物中毒，引发食物中毒的致病菌有沙门氏菌、变形杆菌、金黄色葡萄球菌及蜡样芽胞杆菌。沙门氏菌感染食物中毒22例（占40.74%），变形杆菌感染食物中毒9例（占16.67%），金黄色葡萄球菌感染食物中毒12例（占22.22%），蜡样芽胞杆菌感染食物中毒11例（占20.37%）。从感染病菌类型看，感染型细菌引起的中毒人数明显高于毒素型细菌中毒人数（P＜0.05）；所有患者致病菌经常规聚合酶链式反应检测与多重荧光定量PCR试剂盒检测，两种检测结果均一致，检出率为100%。多重荧光定量PCR的基因组DNA检测灵敏度只有2×10-6 ng/?l，常规PCR检测敏感度为2×10-7 ng/?l，常规聚合酶链式反应检测能更为准确地检测患者食物中的多种致病菌，但需消耗大量的试剂且所需的检测时间长，多重荧光定量PCR检测所需试剂少且所需检测时间短，但其检测灵敏度较低。结论 多重荧光定量PCR试剂盒在食物中毒中应用价值明显，4种食物致病菌可以在一次检测种被查出，但其灵敏度低于常规PCR检测，可将两者取长补短，在食物中毒致病菌检测工作中推广应用，保证人们食品食用安全。

关键词：多重荧光定量PCR；常规PCR；致病菌；食物中毒

食物中毒是指健康人食用被细菌、毒素及有毒物质污染的食物所致的急性感染疾病。在临床上，该病患者多表现为恶心、呕吐、腹泻及腹痛等症状，严重者还可出现肢体无力、神经麻木，甚至休克昏迷等，若不及时给予患者针对性干预治疗，会对其生命安全造成严重威胁[1～2]。食物中毒事件事发突然，发病者通常涉及群体且影响较大，需要快速准确找出病症根源，以便及时对患者干预治疗。目前，对食物中毒检测方法很多，包括血常规检查、粪便检查及病原学检查等。常规检测方法需对样本进行分离培养，不仅操作复杂，还需要花费大量的时间，且检测过程中样本易受到污染，难以保证检测结果的准确性。荧光定量PCR技术的出现与发展，弥补了传统检测方法的不足，特别是多重PCR检测技术的应用，是在原有PCR基础上加以改进，实现了多种食源性致病菌的同时检测。有研究显示，多重荧光定量PCR检测应用于食物中毒中，提高了检测效率[3]。本研究旨在探讨多重荧光定量PCR试剂盒在食物中毒病原菌检测中的应用效果。

1材料与方法

1.1 材料

1.1.1 仪器设备

2720 Thermal Cycler热循环仪（由美国Life Technologies提供）、DYY-6C电泳仪（由北京六一仪器厂提供）、Centri-Fuge FRESCO 17 低温高速离心机（由美国Therrmo提供）、HDLⅡ生物安全柜（由北京东联提供）、SPX-250B-Z生化培养箱（由上海博迅提供）、Image Quant 300凝胶成像系统及超纯水系统（由美国Millipore提供）。

1.1.2 试剂

实验试剂有Tap酶、PCR及Mg2+细胞裂解缓冲液（均为Promega公司提供）、琼脂糖DNA 纯化试剂盒（由青岛生工生物科技有限公司提供）、DL2000TM DNA Marker与100bp DNA Ladder Marker（均由大连宝生物工程TaKaRa有限公司提供）及溴化乙锭（由美国Gibco公司提供）。

1.1.3 菌株

实验室所使用的标准菌株均为本疾控中心提供，并保存于本实验室。

1.2 方法

1.2.1 菌株培养

参照GB/T4789.1-2008对现场采集的食物中毒的样本中细菌进行培养。

1.2.2 PCR引物设计

对细菌基因组的DNA提取，主要采用相关试剂盒提取，按照试剂盒操作说明书严格执行，保存于-20℃备用。之后以细菌的基因组DNA为模板，根据GenBank中6种食源性致病菌的序列，分析液体序列后筛选出靶序列，然后根据靶序列利用设计的引物对目的基因片段扩增。常规PCR反应体系为：10×PCR Buffer solution 2.5 ?l，2?lDNA模板，引物1?l，dNTP为0.5 ?l，Taq DNA 聚合酶为0.5?l，ddH2O为17.5 ?l。PCR反应单循环条件参数：预变性95℃ 3 min，反应35个循环，每个循环变性94℃ 30 s，退火58℃ 1 min，延伸72℃ 1 min；循環结束后延伸72℃ 10 min，直到冷却为16℃，产物4℃保存后备用。取5 ?l PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳（3%）与紫外凝胶成像系统观察最后的结果，PCR反应的退火温度为50℃～62℃，根据电泳图带的亮度选择合适的退火温度，其余PCR其余置入4℃保存留用。

1.2.3 多重荧光PCR反应

基于单一PCR反应后，对多重荧光定量PCR反应，其相关体系中除了引物0.5 ?l外，其余均一样。多重PCR反应单循环参数：预变性95℃ 3 min，反应40个循环，每个循环变性94℃ 30 s，退火62℃ 1 min，延伸72℃ 1 min；循环结束后延伸72℃ 10 min，直到冷却为16℃，产物4℃保存后备用。取5 ?l PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳（3%）与紫外凝胶成像系统观察最后的结果，PCR反应的退火温度为48℃～72℃，根据电泳图带的亮度选择合适的退火温度，其余PCR产物置入4℃保存留用。在此检测过程中严格遵守无菌操作与标准化采集方式，按照仪器与试剂盒操作说明执行。

1.2.4 常规PCR与多重荧光PCR反应灵敏度比较

测定样品中致病菌菌株基因组DNA的浓度，将其调整到20 ng/?l，按照10被梯度稀释，灵敏度的试验的DNA浓度为2×10-2×10-10 ng/?l，每个浓度的DNA各取2 ?l后进行常规PCR与多重荧光PCR反应灵敏度的比较实验，以此获得结果。

1.3 统计学处理

数据处理采用SPSS 22.0统计学软件，计量资料以（±s）表示，采用ｔ检验，计数资料用率表示，采用χ2检验，（P＜0.05）为差异具有统计学意义。

2结果

2.1 食物中毒致病菌检出情况

54例患者均为食源性食物中毒，引发食物中毒的致病菌有沙门氏菌、变形杆菌、金黄色葡萄球菌及蜡样芽胞杆菌4种。沙门氏菌感染食物中毒者最多，其次为变形杆菌感染食物中毒者。感染型细菌引起的中毒人数明显高于毒素型细菌中毒人数（P＜0.05）。见表1。

2.2 常规PCR与多重荧光PCR反应灵敏度比较

用两种PCR同时扩增进10倍稀释的标准菌株基因组DNA，常规PCR在DNA的量低至2×10-7 ng/?l时可扩增出清晰特异性的目的条带，多重荧光定量PCR在2×10-1 ng/?l可扩增出金黄色葡萄球菌、蜡样要胞杆菌，在2×10-3 ng/?l时只能扩增出前者金黄色葡萄球菌，后者则不能扩增出，当基因组DNA浓度达到最大浓度时金黄色葡萄球菌 扩增不出来，以此确定出常规PCR检测敏感度为2×10-7 ng/?l，而多重荧光定量PCR灵敏度只有2×10-6 ng/?l。所有患者致病菌经常规聚合酶链式反应检测与多重荧光定量PCR试剂盒检测，两种检测结果均一致，检出率为100%。

3讨论

食品安全关系到人们身体康健与基本社会生产活动的正常开展，一直以来受到各界人士的广泛关注[4]。近年来，随着社会经济发展水平的提高，一些企业与商家为了自身利益，在食品原料生产加工过程中被细菌污染的风险提高，而这些致病菌种类较多，不但会给企业造成重大的经济损失，还会危害人们的生命安全。据世界卫生组织调查报告显示[5]，全球每年因食物中毒而死亡的约有42万人，约5500万人因食源性因素造成腹泻，其中因腹泻死亡约23万人。目前，引起食源性致病菌种类达300种，对这些致病菌的检测，是保障食品安全的最基本的要求，而如何快速准确检测出致病菌是当前相关结构开展工作的难点[6]。

现阶段，对食物中毒人员病原菌的检测方法有许多，传统的诊断办法是对患者粪便、呕吐物等进行细菌学培养观察，最后得出检测结果。该检测方法耗时较长，且所使用的实验检测资源耗费量大，加上在检测过程中容易受到污染，易造成结果不准确等问题，在一定程度耽误了患者最佳治疗时机。而实施荧光定量PCR是在定性PCR基础上发展而来的核酸定量技术，通过利用荧光信号积累实时监测整个PCR过程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析，该检测方法具有灵敏度高、准确性高、特异性强、操作简便及快速等特点，在食源性致病菌监测中应用效果良好[7～9]。

本研究结果显示，54例患者均为食源性食物中毒，引发食物中毒的致病菌有4种，分别为沙门氏菌、变形杆菌、金黄色葡萄球菌及蜡样芽胞杆菌。从感染病菌类型看，感染型细菌引起的中毒人数明显高于毒素型细菌中毒人数（P＜0.05）。对所有患者进行致病菌经常规聚合酶链式反应检测与多重荧光定量PCR试剂盒检测，两种检测结果均一致，检出率为100%。多重荧光定量PCR的基因组DNA检测灵敏度只有2×10-6 ng/?l，常规PCR检测敏感度为2×10-7 ng/?l，常规聚合酶链式反应检测能更为准确的检测患者食物中的多种致病菌，但需消耗大量的试剂且所需的检测时间长，多重荧光定量PCR检测所需试剂少且所需的检测时间短，但其检测灵敏度较低。这是由于多种荧光定量PCR监测是基于常规PCR基础上衍生出的多种分子生物学方法，通过利用两对或两对以上的引物及荧光标记探针对多个目标序列同时监测，该方法克服了常规PCR的不足，可缩短检测周期，减少成本，提高效率，在食物中毒中应用价值明显。

综上所述，多重荧光定量PCR试剂盒在食物中毒中应用价值明显，4种食物致病菌可以在一次检测种被查出，但其灵敏度低于常规PCR检测，可将两者取长补短，在食物中毒致病菌检测工作中推广应用，保证人们食品食用安全。

参考文献

[1] 龙慧，龙永艳，王伟，等.食物中毒样品中大肠埃希氏菌的分离、检测和鉴定[J].现代食品，2022，28（5）：142-146.

[2] 王华健，张宁，杨威，等.3种食源性致病菌TaqMan多重荧光定量PCR检测方法的建立[J].畜牧兽医学报，2022，53（4）：1201-1209.

[3] 倪阳.实时荧光定量PCR在食品致病菌檢测中的应用[J].食品安全导刊，2020（21）：161.

[4] 程春荣，周鹏，戴蕾，等.一起疑似产气荚膜梭菌食物中毒事件的实验室检测分析[J].疾病监测，2022，37（8）：1125-1128.

[5] 方丽萍.细菌性食物中毒20例实验室病原菌检测[J].武警后勤学院学报（医学版），2014，23（9）：764-765.

[6] 章海通，邢家溧，傅晓，等.食源性金黄色葡萄球菌产肠毒素情况及耐药性分析[J].食品研究与开发，2019，40（20）：175-179.

[7] 欧秀华，邱艺燕.一起肠炎沙门菌食物中毒的实验室检测分析[J].热带病与寄生虫学，2022，20（2）：89-90，98.

[8] 王蒋丽，李彩云，王伟等.一起蜡样芽胞杆菌食物中毒的病原菌检测分析[J].医学动物防制，2017，33（4）：468-469.

[9] 杨顺革.一起沙门菌食物中毒病原菌检测分析[J].中国城乡企业卫生，2016，31（3）：48-49.