蛋糕中合成色素的高效液相色谱检测研究

许桦 邓金凤

目前，合成色素已广泛应用于食品生产加工中，在蛋糕生产中也多有应用。合成色素即人工合成的色素，具有色泽鲜艳、着色力强、色调多样等优点，但也有一个大缺点，即具毒性（包括毒性、致泻性和致癌性），因而会对人体造成不同程度的危害。基于此，本研究以蛋糕为研究对象，采用高效液相色谱法（HPLC）对蛋糕中的合成色素进行了检测。

一、材料与设备

1.材料与试剂。甲醇（预层析纯化、过滤脱气），瑞典Upson Chemical Co.，Ltd.；醋酸铵（超纯，0.02mol/L溶液配制，脱气过滤器），百威化学有限公司；醋酸锌（可用21.9%水溶液）、鐵氰化钾（可用10.6%水溶液）、无水乙醇、氨水、柠檬酸（可用20.0%水溶液），均为分析纯；聚酰胺粉末（100-200目），中国医药集团实业有限公司；柠檬黄、苋菜红、胭脂红、日落黄、诱惑红、亮蓝、赤藓红、新红，国家研究中心参考资料；Low Performance Polyamide （2g，12mL），Angelen Technology Ltd.；测试水-超纯水（电阻率18.3mq/m2）；市售蛋糕。

2.试验设备。主要仪器包括紫外检测器、高速离心机、涡流发生器、低温制冷机和24位标准固相萃取仪。

二、试验与方法

1.试验溶液制备。合成色素分析中的溶液主要有柠檬酸溶液、柠檬酸钠溶液、醋酸铵溶液、无水乙醇、柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液、标准储备液和混合标准溶液。先将柠檬酸溶液与21.01g柠檬酸和1L水混合，充分搅拌；再取29.41g柠檬酸钠溶液与1L水混合均匀；配置无水乙醇溶液时，将70mL无水乙醇、20mL氨水和10mL水充分混匀；从标准储备液中取上述色素0.1g，放入容量为100mL的瓶装水中，至多100mL；配制混合标准溶液时，取上述溶液2mL，加水100mL配成染料。

2.高效液相色谱条件。色谱柱：C18柱，5hm，4.6mm*250mm；流速：1.0mL/min；柱温：30℃；注射次数：10次；柠檬黄、苋菜红、胭脂红、日落黄、诱惑红和赤藓红的检测波长为254nm，亮蓝色的检测波长为595nm；0.02mol/L醋酸铵和甲醇为流动相，洗脱梯度如表1所示。

3.曲线标准。取1mg/mL的柠檬黄、苋菜红、胭脂红、日落黄、诱惑红、亮蓝、苔藓红、新红标准品，精密吸取0.1mg/mL的混合标准液0.10mL、0.25mL、0.50mL、0.75mL、1.0mL，分别置于5个10mL容量瓶中，用现制的一级水定容至刻度摇匀，制剂新红的浓度分别为1.0μg/mL、2.5μg/mL、5.0μg/mL、7.5μg/mL、10.0μg/mL。另精密吸取0.1mg/mL的混合标准液1.0mL、2.5mL、5.0mL、7.5mL、10.0mL，分别置于5个10mL容量瓶中，用超纯水定容后摇匀，制得标准浓度分别为10μg/mL、25μg/mL、50μg/mL、75μg/mL、100μg/mL的混合标准溶液。根据色谱条件进行高效液相色谱分析，根据峰面积和对应浓度生成标准曲线。

4.试验方法。（1）选择一部分蛋糕进行均质化。（2）将5g蛋糕样品放入30mL离心管中，再放入10mL无水乙醇、氨水和水的混合液中，超声处理10min，离心10min，选择澄清的沉淀液，然后继续加入无水乙醇混合溶液，提取两次。（3）选择提取的清洗液，在-42℃条件下冷冻0.5h、1h、3h、5h、12h。冷冻后，将离心机放入冷冻离心机中离心5min，然后取出清洗液。（4）除去透明溶液并在高温下浓缩，调节pH值至6-7以获得浓缩溶液。（5）将浓缩液用固相聚酰胺萃取塔过滤，用柠檬酸钠溶液精制，再用无水乙醇和氨水混合液精制，将初期流出液清除后，保存剩余流出液，在50℃条件下将氮气增浓至0.8mL，再加入0.2mL醋酸铵溶液残渣，配制液用水微孔滤器过滤，滤液用液相色谱法测定。（6）优化层析条件。色谱柱的温度保持在30℃，流动相A为0.02mol/L醋酸铵溶液、0.02mol/L醋酸钠氨溶液，流动相B为甲醇。（7）制作基质匹配标准曲线，取5g空样置于30mL离心管中，分别加入不同量的合成染料，直至完全均匀冷却，重复提取操作。

三、研究与分析

1.优化处理样品。（1）样品的预处理。蛋糕基质含有大量的脂肪和蛋白质，会阻碍后续实验，必须提前去除。8种色素易溶于水，不溶于油，故本试验采用油醚萃取脱脂，效果较好，色素回收率也未受到严重影响。由于蛋白质会吸附色素，本实验使用21.9%的醋酸锌和10.6%的铁氰化钾溶液进行蛋白质沉积，同时加入软膏以提取色素。在强烈的超声波振动下，包裹在蛋白质中的色素被释放到样品提取物中。

（2）优化清洗条件。提取物通过持久性聚酰胺提取进行精制，并与聚酰胺粉末的吸附性进行比较。聚酰胺粉末吸附法需要较高的运行温度，色素回收率非常低，而聚酰胺柱固相萃取工艺简单，溶剂含量低，8种色素的回收率均得到显著提高。

（3）优化色谱条件。本试验测试了8种合成色素的分离，流速分别为0.3mL/min、0.5mL/min和1.0mL/min。当流速为0.5mL/min时，8种色素分离良好，峰值尖锐，分析效果好，分析时间中等。结合达到峰值时间、色素分离效果、仪器柱压力等因素，最终确定0.5mL/min为最佳流速。8种色素基本上可以在四个温度下分离，但由于测量温度高于室温，环境对测量温度影响不大，温度波动小，因此选择30℃作为测量温度。

2.选择固相萃取柱。固体萃取塔由固体吸附剂组成，将吸附试样中的目标化合物与主要干扰物质分离，然后用去污剂清洗，达到分离和浓缩的目的。市场上大多数的固相吸附剂很相似，通常导致回收率低，纯度不完整，分析材料重复性差。将市场上销售的多个固相萃取塔进行比较，发现Strata X-AW固相萃取塔可以有效满足实验要求。Strata X吸附剂采用创新的聚合物技术，其中二胺基是带电酸性化合物，能够100%洗涤，切实提高检测方法的灵敏度和可重复性。

3.曲线检出限。曲线检出限的测试结果如表2所示。从表2可知，采用该测试方法对8种线性范围宽、线性好、检出限低的合成色素进行分离分析，可以满足装饰蛋糕中合成色素的检测要求。

为检测样品中8种合成色素的回收率和精密度，选取空白蛋糕加入8种不同牌号的合成色素，按试验方法配制样品溶液，测定6次的回收率和相对标准偏差。取出后，将精制后的溶液放入冰箱-4℃降温，每隔1h、4h、8h、12h、24h、48h、168h取样，室温保存，待测。机器比较储存时间与样品溶液对目标物质的影响结果表明，样品溶液在-4℃下冷却一周，各色素的出峰时间无明显变化，色谱峰重现良好，说明样品溶液在-4℃下冷却一周并不影响检测结果，适用于批量样品处理检测。

4.样品提取优化。在蛋糕中加入少量色素，可以使蛋糕更加美观。本实验以5g阴性样品中6种色素含量为4mg/kg作为研究对象，对环境条件的优化进行研究，包括提取溶剂的选择、提取时间、提取温度的确定。由于色素易溶于水和微量液体，故选用水、0.4%氢氧化钠水溶液和0.4%氢氧化钠乙醇水溶液作为提取溶剂进行比较，其他操作与色谱研究完全相同，只是将样品加入标准样品中，提取时间为1次。实验发现，样品中的色素能被水溶解，提取物的颜色很浅，色素明显牢固地吸附在固体上。结果表明，0.4%的氢氧化钠水溶液可以提取部分色素，但对浅色素的提取十分不利。

5.聚酰胺粉用量。实验研究了两种聚酰胺粉末和不同用量对8种色素吸附和解吸的影响。使用市场上常用的两种粉末，实验中检测到的聚酰胺粉体和色素的种类与数量在萃取液酸化后吸附良好，但30-100目聚酰胺粉体解吸不完全，有部分残留色素。聚酰胺粉末的用量对分析结果影响很大，100-200目聚酰胺粉的回收率远高于30-100目，使用0.5g聚酰胺粉末时回收量超过1.0g，回收率为90%-97%。可以看出，粉末含量低，颗粒大，颗粒中吸附的色素不能被解吸液完全分解吸收，导致还原率低；粉末含量高，细粉，解吸完全。因此，选择0.5g的100-200目聚酰胺粉末作为试验条件。

6.油脂去除分析。蛋糕制品含有大量脂肪，如果脂肪没有完全去除，会影响和干扰实验。实验中，在阴性样品中加入标准溶液（4mg/kg）作为实验样品进行实验对比。在第一组实验中，提取物中含有大量的油，酸化后变得浑浊，聚酰胺粉末没有完全吸收色素，一些色素留在溶液中。同时，包封在油中的色素无法通过过滤释放出来。虽然g2玻璃砂砾漏斗和70%乙醇水溶液在后续抽滤中可以去除部分油脂，但最终溶液中仍有杂质存在；基本漂移和剧烈波动会严重影响8种色素的结果分析和检测灵敏度；回收率很低，结果仅为55%-65%。在第二组中，脱脂后的样品根据上述实验操作进行处理，结果显著优于非脱脂组。

在选择萃取溶剂时，本实验比较了混合溶剂乙醚和石油醚的分析效果。采用乙醚萃取时，诱惑红的萃取率很低，只有50%，而其余五种色素的萃取率为80%-83%。采用石油醚（1+1）混合液萃取，可以显著提高诱惑红的回收率，效果达到90%以上，剩下的7个结果也很不错。因此，选择石油醚（1+1）混合溶液作为萃取溶剂。

作者简介：许桦（1993-），男，汉族，广西貴港人，助理工程师，大学本科，研究方向为食品检测。

邓金凤（1993-），女，汉族，广西贵港人，助理工程师，大学本科，研究方向为食品检测。