固相萃取-液相质谱联用测定大豆中异黄酮类化合物的方法研究

姜川 范蕾 张夏翊 邹小龙 陈梦 汪昕

大豆异黄酮是一种植物化学素，属植物黄酮类，主要来源于豆科植物的荚豆类，在大豆中含量较高。研究发现，大豆异黄酮具有抑制肿瘤生长、降低心血管疾病、预防和治疗骨质疏松以及缓解妇女更年期综合症等多种生理保健作用。

大豆中天然存在的大豆异黄酮共有12种，可以分为3类，即黄豆苷类、染料木苷类、黄豆黄素苷类，每类都以游离型、葡萄糖苷型、乙酰基葡萄糖苷型、丙二酰基葡萄糖苷型这4种形式存在。目前，如何简单准确地测试大豆中异黄酮的含量仍是检测领域一个有待探索的问题，国内外使用较多的测定方法包括高效液相色谱法、液相-质谱联用法、毛细管电泳法等。无论何种测定方法，准确的前处理都是得到可靠结果的关键步骤，因此本研究分别采用直接提取法和SPE 1000全自动固相萃取系统对大豆进行前处理，处理液则同时使用液相-质谱联用设备进行测定，对大豆苷、染料木苷、黄豆苷、大豆素、染料木素、黄豆素6种元素进行回收率的测定对比。

一、材料与方法

1.试剂。正己烷（色谱纯，Fischer公司）；甲醇（色谱纯，Fischer公司）；乙酸乙酯（色谱纯，Fischer公司）；大豆异黄酮对照品溶液（Anpel公司，纯度96.5%）。

2.实验材料。大豆（市场购得）。

3.实验仪器。SPE 1000，全自动固相萃取系统，LabTech公司；Flex-MVP，全自动真空浓缩仪，LabTech公司；SCIEX Exion LC?液相系统+Triple Quad? 4500质谱，液质联用仪，SCIEX公司。

4.试验方法。（1）直接提取法。精确称取5g大豆样品，加入90%甲醇水溶液90mL，60℃超声提取30min，10000r/min离心10min，转移上清液。在残渣中再加入90%甲醇水溶液60mL，重复上述提取、离心操作。合并两次提取液，真空浓缩至40mL，再用10%甲醇水溶液定容至50mL。取0.5mL提取浓缩液，定容至1mL，过0.22μm微孔滤膜，供测。

（2）直提+固相萃取法。精确称取5g大豆样品，加入90mL正己烷，60℃超声提取30min，10000r/min离心10min，转移上清液。在残渣中再加入60mL正己烷，重复上述提取、离心操作。合并两次提取液，真空浓缩至40mL，再用正己烷定容至50mL。取5mL浓缩液，通过已经活化过的硅胶固相萃取柱（5mL甲醇、5mL正己烷活化小柱，流速1mL/min），再用10%乙酸乙酯正己烷溶液5mL淋洗小柱，淋洗液不收集。用6mL甲醇洗脱，收集洗脱液。用10%甲醇水溶液定容至10mL，取1mL，过0.22μm微孔滤膜，供测。

5.实验部分。量取0.5g均质后的大豆样品置于50mL离心管中，加入10mL甲醇溶液（甲醇：水=9：1），60℃超声提取30min，4000r/min离心5min，将上清液放入150mL浓缩瓶中。在残渣中加入5mL甲醇溶液（甲醇：水=9：1），60℃超声提取30min，4000r/min离心5min，将上清液也转入150mL浓缩瓶中。真空度100mbar，水浴40℃浓缩至近干，分别加入90%甲醇溶液（甲醇：水=9：1）、50%甲醇溶液（甲醇：水=5：5）复溶，定容至10mL，取1mL过膜，作为直提样品上样。同样处理复溶后，分别用C18、HLB、C18-U（500mg/3mL）固相萃取柱进行固相萃取，收集过柱后溶液，并用10mL甲醇洗脱固相萃取柱，分别取1mL过膜后上样。

量取0.5g均质后的大豆样品置于50mL离心管中，分别加入90%甲醇溶液（甲醇：水=9：1）10mL、50%甲醇溶液（甲醇：水=5：5），60℃超声提取30min，4000r/min离心5min，将上清液放入15mL离心管中。在残渣中加入5mL对应浓度的甲醇溶液，60℃超声提取30min，4000r/min离心5min，再将上清液也转入15mL离心管中。用HLB（500mg/3mL）固相萃取柱进行固相萃取，收集过柱后溶液，并用10mL甲醇洗脱固相萃取柱，分别取1mL过膜后上样。

二、分析条件

1.液相方法条件。色谱柱：不锈钢柱，内径4.6mm、长250mm的C18柱，填料粒径10μm。流动相A：1‰甲酸水，流动相B：乙腈。进样量：10.0μL。流量：1mL/min。柱温：30℃。洗脱程序设置如表1所示。

2.质谱方法。离子源温度：550℃；IS电压：5500V；流速：0.25mL/min；离子源：ESI，正离子模式。异黄酮类质谱参数如表2所示。

三、结果与讨论

1.实验结果。（1）大豆苷直接提取法和固相萃取法的色谱图对比，如图1所示。

（2）大豆素直接提取法和固相萃取法的色谱图对比，如图2所示。

（3）黄豆苷直接提取法和固相萃取法的色谱图对比，如图3所示。

（4）黄豆素直接提取法和固相萃取法的色谱图对比，如图4所示。

（5）染料木苷直接提取法和固相萃取法的色谱图对比，如图5所示。

（6）染料木素直接提取法和固相萃取法的色谱图对比，如图6所示。

（7）固相萃取法和直接提取法的回收率对比，如表3所示。

2.结论与讨论。实验对比发现，大豆苷、染料木苷、黄豆苷、黄豆素、大豆素、染料木素在经过直接提取法处理后，使用质谱测试的回收率分别为29.4%、27.0%、32.1%、34.1%、83.3%、90.8%。由此可見，除了大豆素和染料木素，其他几种物质在前处理过程中已经有很大的损失，这给准确定量带来了巨大的困难。反之，使用固相萃取法提取的大豆苷、染料木苷、黄豆苷、黄豆素、大豆素、染料木素的回收率分别为100.8%、105.6%、104.8%、102.1%、98.9%、100.3%。由此可见，使用固相萃取法对待测物质进行收集和洗脱后，再使用质谱测试，能够得到非常好的回收率。

基金项目：浙江省市场监督管理局检验检测技术装备项目“高盐稀态酱油残渣中大豆异黄酮提取与检测技术的研究与开发”（ZB2022475）。

作者简介：姜川（1979-），男，汉族，黑龙江哈尔滨人，副教授，硕士研究生，研究方向为食品检验、分析测试。