急性马兜铃酸中毒小鼠肾损伤及Wnt7b/β-catenin/MMP-7的表达变化

王一凡，刘爽，汪思齐，李茂娟，黄春华，楼迪栋

（1.贵州中医药大学基础医学院法医学教研室/贵州中医药大学司法鉴定所，贵阳 550000；2.贵州省法医中药毒理学特色重点实验室，贵阳550000）

马兜铃酸（aristolochic acids，AA）是马兜铃科中药材的主要毒性成分，能引起肾损伤和纤维化［1］。其中AAⅠ的毒性最大［2］，摄入含有AA的中草药引起的急性或慢性肾小管间质疾病被称为AA肾病（aristolochic acid nephropathy，AAN）［3-5］。临床上对含有AA中草药的使用有严格的规范，但相关中毒事件仍有发生［6］，如未及时治疗会发展为慢性肾功能衰竭，最终形成终末期肾病［7］。

Wnt通路在机体发育、损伤修复过程中发挥着重要作用［8］。研究表明，Wnt7b能够促进肾脏发育过程中肾小管的增殖分化［9］，参与斑马鱼肾脏损伤后的再生修复［10］，但Wnt7b在哺乳动物致肾脏损害发展过程中的作用机制仍缺乏基础研究。本研究通过连续观察急性AAN不同时期和部位的肾脏病理改变及Wnt7b相关蛋白的表达变化，探讨急性AAN过程中的组织病理特征和Wnt7b通路作用机制，为明确AA的毒理机制提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 药物和试剂

AAⅠ标准品（纯度96%，四川省维克奇生物科技有限公司），溶于二甲基亚砜（北京索莱宝科技有限公司）与0.4%羧甲基纤维素钠（上海展云化工有限公司）中，制成2 mg/mL AAⅠ悬浊液。HE染色液（北京索莱宝科技有限公司），免疫组化（immunohistochemistry，IHC）SP试剂盒（北京中杉金桥生物技术有限公司），Wnt7b兔多克隆抗体（赛默飞世尔科技中国有限公司），β-catenin鼠多克隆抗体（武汉三鹰生物技术有限公司），基质金属蛋白酶-7（matrix metalloproteinase-7，MMP-7）兔多克隆抗体（武汉三鹰生物技术有限公司）。

1.2 实验动物

雄性KM小鼠（长沙市天勤生物技术公司）113只，8周龄，质量（32±5）g，于贵州中医药大学实验动物中心饲养，常温环境，自由摄食、饮水。实验过程严格按照《实验动物福利伦理审查指南（GB/T358922018）》要求执行。

1.3 动物分组及给药

将113只KM小鼠于笼中适应性喂养3 d，自由进食进水。

1.3.1 生存曲线给药方式：将75只小鼠随机分为5组（n=15），每组小鼠分别灌胃给药AAⅠ20 mg/（kg·d）、15 mg/（kg·d）、10 mg/（kg·d）、5 mg/（kg·d）及0 mg/（kg·d）（溶剂对照）。

1.3.2 急性AAⅠ中毒模型给药方式：将48只小鼠随机分为2组（n=24），溶剂对照组小鼠灌胃给药AAⅠ 0 mg/（kg·2 d），模型组小鼠灌胃给药AAⅠ 5 mg/（kg·2 d）。

1.4 样本采集

用药后，对照组和模型组的小鼠各随机取6只分别于第2、4、6和8 天戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，颈椎脱臼处死，摘眼球取血后，用PBS和固定液全身灌注，取双侧肾组织样本，沿矢状面分为2份，PBS冲洗，一份浸入4%多聚甲醛固定，另一份用2.5%戊二醛固定。

1.5 肾功能检测

将采集的血液标本1 200 r/min 4 ℃离心10 min，取上清，用mindray生化免疫流水线检测其血肌酐和尿素氮含量。

1.6 组织病理学染色

将4%多聚甲醛固定的肾脏组织经乙醇梯度脱水、二甲苯透明、浸蜡、包埋后切片（切片厚度2～4 μm），进行HE染色与Masson染色，光学显微镜下观察肾脏组织病理变化，并对肾小管损害指标等计数统计。

1.7 IHC染色

切片样本放置于60 ℃烘箱中融蜡2 h，二甲苯脱蜡、乙醇梯度脱水。PBS冲洗后，置于100 ℃的柠檬酸缓冲液（pH6）中，微波炉高火加热20 min，PBS浸洗。随后滴加内源性过氧化物阻断酶室温孵育，PBS浸洗。分别加入Wnt7b（1∶200）、β-catenin（1∶200）和MMP-7（1∶100）3种蛋白的一抗，4 ℃冰箱孵育过夜，结束后用PBS浸洗。滴加生物素标记山羊抗小鼠/兔IgG，37 ℃孵育15 min，PBS浸洗，滴加辣根酶标记链霉素工作液，37 ℃孵育15 min，PBS浸洗。滴加DAB显色液，PBS浸洗终止染色，苏木素复染，酒精梯度脱水，二甲苯透明，封片。用ImageJ软件对IHC图像进行分析统计。

1.8 免疫电镜

将组织从2.5%戊二醛固定后取出，乙醇梯度脱水，树脂渗透后进行包埋。超薄切片机切成70～80 nm超薄切片，超纯水悬浮 5 min，进行复温后TBS清洗，用1%BSA 封闭液室温封闭 30 min，加入Wnt7b（1∶200）和 β-catenin（1∶200）4 ℃过夜孵育，TBS清洗，加入4 nm胶体金羊抗鼠抗体（抗β-catenin）和12 nm胶体金羊抗兔抗体（抗Wnt7b），37 ℃烘箱孵育1 h，TBS清洗。铀复染后用70%乙醇清洗，滤纸吸干后放入网板中，透射电子显微镜下观察并采集图像。

1.9 统计学分析

Masson染色和IHC的图像参考DESHPANDE 等［11］的方法，采用ImageJ软件对光密度平均值进行统计，用随机区域计数法对HE图像和IHC图像计数统计。采用SPSS 24.0软件进行统计分析，数据均以±s表示，多组间统计学差异（方差齐性检验后）采用单因素方差分析比较。P＜ 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 AAⅠ与小鼠生存曲线

将小鼠暴露于不同浓度的AAⅠ中，AAⅠ的浓度与小鼠生存时间呈负相关。当小鼠灌胃的AAⅠ浓度为20 mg/（kg·d）时，小鼠表现出急性毒性效应，5～8 d出现高死亡率。当AAⅠ浓度降至10 mg/（kg·d）时，小鼠的死亡率稍降低，当AAⅠ的浓度降至5 mg/（kg·d）时，小鼠生存率显著上升；3组生存曲线与对照组相比有统计学差异（P均＜0.05），见图1。

图2 HE和Masson染色代表性图像 × 20 Fig.2 Representative images stained by HE and Masson × 20

2.2 小鼠肾脏生化指标

血清肌酐和尿素氮检测结果显示，模型组血清肌酐在小鼠暴露于AAⅠ 6～8 d时出现显著上升，8 d时为对照组的25倍，尿素氮也随着小鼠暴露于AAⅠ的时间增加，8 d时出现统计学差异（P＜ 0.05）。见表1。

表1 小鼠血清肌酐和尿素氮（±s，n=3）Tab.1 Serum creatinine and urea nitrogen levels in mice（±s，n=3）

表1 小鼠血清肌酐和尿素氮（±s，n=3）Tab.1 Serum creatinine and urea nitrogen levels in mice（±s，n=3）

1）P ＜ 0.05 vs control group.

2.3 小鼠肾脏组织病理学

HE染色结果显示，小鼠肾小管损伤程度随着AAⅠ暴露时间增加而加重，肾小球无明显改变；暴露于AAⅠ 2 d后，50%以上近端小管（proximal convoluted tubule，PCT）刷状缘破坏，伴部分上皮细胞水肿，空泡样变性；4 d时85%以上的PCTEC水肿，并出现少量坏死；6 d时坏死的PCT上皮细胞（proximal convoluted tubule epithelial cells，PCTEC）逐渐从基底膜脱落；8 d时PCTEC坏死脱落增加，肾小管出现大量基底膜裸露，管型数量增加（P＜ 0.05）。皮髓交界（corticomedullary-junction，CMJ）在暴露于AAⅠ 6～8 d时出现大量管型，远曲小管（distal convoluted tubule，DCT）和集合管（collecting tubule，CT）在8 d时出现少量水肿。Masson染色结果显示，AAⅠ暴露8 d后，肾皮质胶原容积分数（collagen volume fraction，CVF）较对照组显著上升，有统计学差异（P＜ 0.01）。见图 2、表2。

表2 肾小管损伤程度及Masson染色胶原容积分数（±s，n=3）Tab.2 Extent of renal tubular injury and collagen volume fraction determined by Masson staining（±s，n=3）

表2 肾小管损伤程度及Masson染色胶原容积分数（±s，n=3）Tab.2 Extent of renal tubular injury and collagen volume fraction determined by Masson staining（±s，n=3）

1）P ＜ 0.01 vs control group.

2.4 小鼠肾脏Wnt7b、β-catenin和MMP-7 IHC结果

Wnt7b的IHC结果显示，模型组Wnt7b表达量上升，8 d时达到最高（主要聚集于刷状缘）；暴露于AAⅠ8 d时，PCT、CMJ和CT处的Wnt7b的IHC平均光密度值增高，PCT的表达量增高至2 d时的2.5倍（P均＜0.05）；Wnt7b阳性的PCT比例增加，6～8 d时Wnt7b阳性小管数为70%（P均＜0.05）。见图3、表3。

表3 Wnt7b免疫组化平均光密度值及阳性肾小管比例（±s，n=5）Tab.3 Proportions of positive PCT cells and mean optical density of tissues stained with Wnt7b（±s，n=5）

表3 Wnt7b免疫组化平均光密度值及阳性肾小管比例（±s，n=5）Tab.3 Proportions of positive PCT cells and mean optical density of tissues stained with Wnt7b（±s，n=5）

1）P ＜ 0.01 vs control group；2）P ＜ 0.01 vs 2 d.

图3 3种蛋白近端小管免疫组化染色代表性图像 × 20Fig.3 Representative images of immunohistochemical staining of three proteins in the proximal convoluted tubules × 20

β-catenin的IHC结果显示，模型组β-catenin表达量上升（PCT的近基底膜侧）；第8天PCT、CMJ和CT处β-catenin的IHC平均光密度值和阳性小管与对照组相比明显增加，有统计学差异（P＜ 0.05）。见图3、表4。

表4 β-catenin免疫组化平均光密度值及阳性肾小管比例（±s，n=5）Tab.4 Proportions of positive PCT cells and mean optical density of tissues stained with β-catenin（±s，n=5）

表4 β-catenin免疫组化平均光密度值及阳性肾小管比例（±s，n=5）Tab.4 Proportions of positive PCT cells and mean optical density of tissues stained with β-catenin（±s，n=5）

1）P ＜ 0.01 vs control group；2）P ＜ 0.01 vs 2 d.

MMP7的IHC结果显示，模型组MMP7在胞质内表达量上升；PCT、CMJ和CT处MMP7的IHC平均光密度值和阳性肾小管与对照组相比明显增加，有统计学差异（P＜ 0.05）。见图3、表5。

表5 MMP-7免疫组化平均光密度值及阳性肾小管比例（±s，n=5）Tab.5 Proportions of positive PCT cells and mean optical density of tissues stained with MMP-7（±s，n=5）

表5 MMP-7免疫组化平均光密度值及阳性肾小管比例（±s，n=5）Tab.5 Proportions of positive PCT cells and mean optical density of tissues stained with MMP-7（±s，n=5）

1）P ＜ 0.01 vs control group；2）P ＜ 0.01 vs 2 d.

2.5 小鼠肾脏Wnt7b和MMP7免疫电镜结果

免疫电镜结果显示，对照组的PCTEC刷状缘绒毛排列整齐，线粒体嵴清晰，数量较多；暴露于AAⅠ 2 d后PCTEC刷状缘排列紊乱，线粒体数量减少；6 d时PCTEC空泡变性，刷状缘绒毛大量脱落，线粒体数量明显减少，呈“C”或“U”形。对照组未见Wnt7b胶体金颗粒，β-catenin胶体金颗粒主要聚集在细胞膜下；暴露于AAⅠ后，刷状缘出现成簇聚集的Wnt7b胶体金颗粒，β-catenin胶体金颗粒在细胞膜下逐渐减少，核内聚集增加。见图4。

图4 Wnt7b和β-catenin免疫电镜代表性图像Fig.4 Representative immunoelectron microscopy images of Wnt7b and β-catenin proteins

3 讨论

AA致肾损伤事件在非洲、亚洲和欧洲均有发生［12］，而且大量不明原因慢性肾脏病被疑与含有AA的中草药有关［13］。因此，明确急性AAN早期的病理变化，阐明AAN的致病机制，对AAN的诊断和治疗有重要价值。

急性AAN的病理改变表现为肾小管受损，主要累及PCT［4］，本研究连续观察了AAN的肾小管病理学改变，结果显示，AAN以PCT损害为主，且PCTEC的损伤呈时间和AAⅠ浓度依赖性；暴露于AAⅠ后，PCTEC刷状缘绒毛脱落，线粒体形态异常，数量减少，细胞水肿、坏死、脱落。急性AAN的肾脏间质CVF增加，细胞外基质紊乱，胶原纤维增多，呈纤维化改变［14］。DCT和CT的病理改变时间较晚，以细胞水肿为主，AAⅠ主要通过分布于PCT的阴离子选择通道蛋白进入细胞［15］。

目前研究［9］已经证明Wnt4和Wnt11参与肾纤维化过程，但Wnt信号通路在急性AAN过程中的机制并不清楚。巨噬细胞所分泌的Wnt7b在组织损伤诱导的炎症过程中，参与肾小管损伤后的的修复与再生［16-19］。Wnt通路激活后β-catenin在胞质聚集并转移到核内，激活下游基因表达（如参与细胞增殖和迁移的MMP-7）［20-21］。本研究结果显示，AAⅠ可诱导Wnt7b在PCTEC的刷状缘表达，β-catenin从膜下向胞质和细胞核内聚集，核内的表达量增高，MMP-7暴露于AAⅠ后表达量也逐渐升高。在6～8 d 时PCTEC大量坏死，坏死细胞中表达的Wnt7b、β-catenin和MMP-7会随着细胞碎片在肾小管内聚集，使CMJ和CT处的蛋白表达增高，可能参与诱导启动肾祖细胞的增殖修复过程［22］。本研究结果显示，AAⅠ能够激活Wnt/β-catenin信号，可能参与肾小管上皮细胞损伤后的再生与修复过程。

急性AAⅠ中毒小鼠的肾脏损害，主要以PCT上皮坏死和脱落为主，与时间和AAⅠ浓度呈正相关；DCT和CT损伤较轻，以水肿为主；PCTEC的Wnt7b、β-catenin和MMP-7的表达量增高，可能参与肾小管上皮细胞的修复和再生过程。