球毛壳菌固态发酵产抗植物病原真菌活性物质的工艺优化

廖宏娟，江玉梅，冶霞，张志斌，马童雨，朱笃,2

球毛壳菌固态发酵产抗植物病原真菌活性物质的工艺优化

廖宏娟1，江玉梅，冶霞1，张志斌1，马童雨1，朱笃

1江西师范大学生命科学学院/江西省亚热带植物资源保护与利用重点实验室，南昌 330022；2江西科技师范大学生命科学学院/江西省生物加工过程重点实验室，南昌 330013

【目的】优化球毛壳菌（）秸秆固态发酵的培养基组成和发酵条件，提高发酵粗提物的抗真菌活性，为球毛壳菌生物农药的开发及秸秆绿色资源化提供参考。【方法】首先，以粗提物抗9种植物病原真菌菌丝生长的抑制率为评价指标，对培养基中的秸秆（水稻、小麦、玉米、油菜）和氮源（豆粕、麦麸、氯化铵）进行筛选，确定最适发酵培养基组成。随后进行发酵条件的单因素优化，以粗提物对辣椒疫霉的抑制率为评价指标，初步确定各发酵条件的较优范围及对粗提物抗真菌活性影响的程度。基于单因素优化的结果，利用正交设计对发酵条件进行正交优化，各参数的范围如下：发酵时间18—36 d、发酵温度26—32 ℃、培养基初始含水量70%—85%、秸秆与麦麸质量比4﹕1—1﹕1、秸秆粒径20—＞100目。最后，获得球毛壳菌秸秆固态发酵产抗真菌活性物质的最优发酵条件并进行验证。【结果】在筛选固态发酵培养基组成时发现，球毛壳菌以小麦秸秆和麦麸组成的培养基进行发酵所获得的粗提物的抗真菌效果总体上优于其他组成的培养基。在发酵条件单因素优化中，菌液接种量对粗提物抗真菌效果影响不显著，故不对其进行后续的正交优化。正交优化中各发酵条件对球毛壳菌发酵粗提物抗真菌活性的影响极为显著（＜0.001），其影响程度依次为小麦秸秆与麦麸质量比>发酵时间>培养基初始含水量>发酵温度>小麦秸秆粒径。正交优化获得的最优发酵条件为发酵时间24 d、发酵温度26 ℃、培养基初始含水量80%、小麦秸秆与麦麸质量比4﹕1、小麦秸秆粒径60—100目。经发酵条件优化后，1 mg·mL-1的球毛壳菌发酵粗提物对核盘菌、辣椒疫霉、稻瘟病菌、桃褐腐病菌、尖镰孢、黄色镰孢、鞘腐霉、禾谷镰孢、水稻纹枯病菌的抑制率分别为100%、92.86%、85.94%、83.90%、76.12%、73.02%、66.18%、58.96%、52.99%。【结论】经过发酵培养基组成和发酵条件优化后，球毛壳菌的发酵粗提物具有较高的抗真菌活性，可为后续分离、纯化球毛壳菌利用秸秆固态发酵产生的抗真菌活性物质打下基础。

球毛壳菌；秸秆；植物病原真菌；固态发酵；抗真菌活性

0 引言

【研究意义】秸秆是主要的农业废弃物，富含可利用的纤维素资源，但秸秆具致密的木质纤维素结构，因而存在难降解和难以资源化的问题[1]。球毛壳菌（）具有水解酶基因，可产生纤维素酶、半纤维素酶和木质素酶来降解纤维素类物质[2-5]。此外，球毛壳菌是研究最早的生防菌之一，其次级代谢产物种类多样、结构新颖，对多种植物病原真菌有良好的抑制效果[6-8]。因此，利用球毛壳菌以秸秆为底物进行固态发酵，既可以生产拮抗植物病原真菌的活性物质，在一定程度上减少化学农药的使用；又可对秸秆进行绿色资源化利用，将其变废为宝，这对环境保护和农业的可持续发展均具有非常重要的价值和意义。【前人研究进展】球毛壳菌隶属于子囊菌门（Ascomycota）核菌纲（Pyrenomycetes）粪壳菌目（Sordariales）毛壳菌科（Chaetomiaceae）毛壳菌属（），是公认的生产碳水化合物活性酶和抗生素的重要家族，能有效降解纤维素和有机物，同时对其他微生物产生拮抗作用[9-10]。镰孢菌属（spp.）、丝核菌属（spp.）、核盘菌属（spp.）、链格孢属（spp.）和刺盘孢属（spp.）是常见植物病原真菌，球毛壳菌可通过产生具有抗真菌活性的次级代谢产物、产生细胞壁降解酶、诱导植物自身产生系统抗性、促进植物生长发育、重寄生和竞争等多种机制对这些病原菌引起的植物病害进行生物防治[8]。目前，球毛壳菌可利用玉米秸秆[11-12]和水稻秸秆[13]生产具有抑菌和抗肿瘤等多种生物活性的球毛壳菌素A（chaetoglobosin A），还可利用小麦秸秆[14-15]生产一种具有良好抗氧化和抑菌活性的新型胞外多糖，且秸秆基本能够满足球毛壳菌的生长需求，仅需补充少量氮源[11]，因而秸秆可作为球毛壳菌的发酵底物。【本研究切入点】球毛壳菌DX-THS3是从江西省抚州市东乡野生稻茎中分离出的植物内生真菌，该菌在分解甘草秸秆的同时可生产甘草次酸3--单---葡萄糖醛酸和木质纤维素酶[5,16]。球毛壳菌不仅可分解秸秆等纤维素类物质，还是常见的生防菌，其产生的球毛壳菌素类和嗜氮酮类物质多具有抗真菌活性[2-5,8]。但目前用于球毛壳菌产抗真菌代谢产物的培养基绝大多数是合成或半合成的液体培养基，鲜见使用秸秆进行固态发酵生产抗真菌活性物质。且与液态发酵相比，固态发酵在降低原料成本、降低能耗、提高产物浓度和无废水排放方面具有显著优势[17-20]，因此亟需对球毛壳菌利用秸秆固态发酵产抗真菌活性物质的工艺进行探索。【拟解决的关键问题】以球毛壳菌DX-THS3为试验对象，对其固态发酵的秸秆种类、氮源种类、发酵时间、发酵温度、培养基初始含水量、菌液接种量、秸秆粒径、秸秆与氮源质量比进行工艺优化，获得球毛壳菌秸秆固态发酵生产抗真菌活性物质的最优发酵培养基和固态发酵条件。

1 材料与方法

试验于2021年10月至2022年8月在江西师范大学生命科学学院/江西省亚热带植物资源保护与利用重点实验室完成。

1.1 材料

1.1.1 菌株 球毛壳菌DX-THS3为实验室前期从东乡野生稻茎部分离出的植物内生真菌[16]。该菌于2016年1月4日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO：M2016005。

植物病原真菌：核盘菌（YC-24）、尖镰孢（HG-5）、水稻纹枯病菌（SDS-12）和辣椒疫霉（FU-4）均由江西农业大学农学院向妙莲教授赠送；禾谷镰孢（L51）、黄色镰孢（S18）、稻瘟病菌（R10）、鞘腐霉（L99）和桃褐腐病菌（F11）为本实验室保存。

1.1.2 固态发酵基质 水稻秸秆、小麦秸秆、玉米秸秆、油菜秸秆、麦麸末和豆粕末均购于南昌县沃尔得秸秆回收专业合作社。水稻秸秆的总碳和总氮含量分别为372.15、23.59 g·kg-1，小麦秸秆的总碳和总氮含量分别为420.57、19.20 g·kg-1，玉米秸秆的总碳和总氮含量分别为426.91、25.81 g·kg-1，油菜秸秆的总碳和总氮含量分别为367.59、26.93 g·kg-1，麦麸的总碳和总氮含量分别为435.6、44.07 g·kg-1，豆粕的总碳和总氮含量分别为444.76、85.13 g·kg-1。氯化铵（分析纯）购于西陇科学股份有限公司。

1.1.3 培养基 马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基（g·L-1）：200 g马铃薯，葡萄糖20 g，琼脂18 g，pH自然。

马铃薯葡萄糖肉汤（PDB）培养基（g·L-1）：不加琼脂，方法同上。

秸秆固态培养基（优化前）：取16 g秸秆与氮源混合物（秸秆与麦麸和豆粕质量比为2﹕1、与氯化铵质量比为20﹕1）和40 mL蒸馏水于1 L锥形瓶中，121 ℃灭菌20 min。

1.2 主要仪器与试剂

ZWY-2112B恒温摇床（上海智城有限公司），RE-52AA旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂），KQ5200超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司），LDZM-80KCS高压自动灭菌锅（上海申实医疗器械厂），FN2004电子天平（上海精密科学仪器有限公司），PQX-280A-12HM恒温培养箱（宁波莱福科技有限公司）、BCM-1300A生物洁净工作台（苏州安泰空气技术有限公司）、800A粉碎机（永康市红太阳机电有限公司）。分析纯丙酮、甲醇（西陇科学股份有限公司）、乙酸乙酯（成都市科隆化学品有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 菌株活化及培养 将球毛壳菌接种至PDA培养基中，在28 ℃培养箱中培养一周使其活化。待菌株活化后，少量多次刮取菌丝接入到含有150 mL PDB培养基的锥形瓶中，并于28 ℃、160 r/min摇床中培养4—5 d，即可得到种子液。然后将种子液接种到秸秆固态培养基中并拌匀，每瓶接种量为8 mL，于28 ℃培养箱中静置避光发酵14 d。

1.3.2 粗提物制备 发酵结束后，将两瓶发酵物搅碎并合为一瓶，在瓶中加入500 mL丙酮，超声辅助提取30 min，重复3次，收集丙酮提取液并减压浓缩。然后用乙酸乙酯1﹕1萃取3次，收集乙酸乙酯层，将其减压浓缩制得浸膏，用于抗真菌活性测定。

1.3.3 抗真菌活性测定 采用菌丝生长抑制法测定不同固态发酵条件下粗提物的抗真菌活性。将浸膏（粗产物）用甲醇充分溶解，溶液经0.22 μm无菌滤头过滤后与50 ℃左右的PDA培养基混匀，制成1 mg·mL-1的含药平板，以含有等体积甲醇的PDA培养基为空白对照。用直径为6 mm的圆形打孔器在已活化好的植物病原真菌菌落边缘上取相同大小的菌饼，并分别接种于含药和空白对照平板中央，每个处理3个重复，于28 ℃恒温培养箱中黑暗培养。待空白对照组中病原真菌生长至近培养皿边缘时，采用十字交叉法测量菌丝生长直径（除去菌饼直径6 mm），抑菌率按如下公式计算：抑制率（%）=100×（对照组菌落直径-含药组菌落直径）/（对照菌落直径-6 mm）。

1.3.4 固态培养基组成优化 选择水稻秸秆、小麦秸秆、玉米秸秆和油菜秸秆分别作为发酵底物，添加的氮源分别为豆粕、麦麸和氯化铵，对4种秸秆和3种氮源进行全因素试验。在培养基中接入球毛壳菌后，于28 ℃培养箱中静置避光发酵14 d。待发酵结束后，提取发酵粗产物（方法同1.3.2），采用菌丝生长法测定粗提物抗真菌活性，以确定抗真菌活性最高的培养基基质种类。

1.3.5 固态发酵条件优化 固态发酵条件单因素优化：使用抗真菌活性最高的培养基基质（小麦秸秆+麦麸），以发酵时间14 d、发酵温度28 ℃、培养基初始含水量70%、菌液接种量50%、小麦秸秆粒径40—60、小麦秸秆与麦麸质量比2﹕1为基础发酵条件，辣椒疫霉为指示菌。对发酵时间（10、14、18、22、26 d）、发酵温度（24、26、28、30、32 ℃）、培养基初始含水量（50%、60%、70%、80%、90%）、菌液接种量（25%、37.5%、50%、62.5%、75%）、小麦秸秆粒径（10—20、20—40、40—60、60—100、＞100目）、小麦秸秆与麦麸质量比（3﹕1、2﹕1、1﹕1、1﹕2、1﹕3）这6个发酵条件进行单因素优化，研究不同发酵条件下粗提物抗真菌活性的高低，以此确定最优发酵条件范围。

固态发酵条件正交优化：采用SPSS 21.0软件，在单因素优化的基础上，选择发酵时间、发酵温度、培养基初始含水量、小麦与麦麸质量比、秸秆粒径进行5因素4水平的正交试验，并以辣椒疫霉为指示菌，优化球毛壳菌粗提物的抗真菌活性，所设计的因素水平如表1所示。

表1 正交试验因素水平

1.4 数据统计与分析

每个处理至少进行3次平行试验，利用Excel 2019软件进行基本的数据整理和统计。利用IBM SPSS Statistics 21软件并采用单因素（one-way ANOVA）和最小显著差异法（LSD）进行差异显著性检验，以＜0.05作为差异显著性判断标准。利用Origin 2018软件进行图像绘制，图中数据为平均值±标准误。

2 结果

2.1 固态培养基组成优化

在微生物发酵过程中，不同培养基基质对微生物次级代谢产物的影响相当明显。由表2可知，对于同一种秸秆而言，以麦麸为氮源进行发酵时所获得的粗提物的抗真菌活性总体上比其他两种氮源高，因此后续试验选择麦麸作为秸秆培养基的氮源。此外，以麦麸为氮源时，发酵小麦、水稻和玉米这3种秸秆所得粗提物对植物病原真菌的抑制率均较高，但总体上以小麦秸秆+麦麸组合的粗提物抑菌活性最好，特别是对辣椒疫霉、桃褐腐病菌、黄色镰孢和鞘腐霉的抑制效果均显著高于水稻秸秆+麦麸和玉米秸秆+麦麸这两个组合。因此，后续以麦麸为氮源，对球毛壳菌固态发酵小麦秸秆的发酵条件进行优化。

2.2 固态发酵条件单因素优化

2.2.1 发酵时间对粗提物抗真菌活性的影响 由图1-A可知，在设定的发酵时间范围内，随着发酵时间的延长，粗提物对辣椒疫霉的抑制率总体上呈上升趋势，在26 d时抑制率最大。后续选择发酵时间18—36 d为正交试验因素水平。

表2 秸秆与氮源种类对球毛壳菌粗提物抗真菌活性的影响

A：核盘菌YC-24YC-24；B：稻瘟病菌R10R10；C：辣椒疫霉FU-4FU-4；D：桃褐腐病菌F11F11；E：尖镰孢HG-5HG-5；F：黄色镰孢S18S18；G：鞘腐霉L99L99；H：禾谷镰孢L51L51；I：水稻纹枯病菌SDS-12SDS-12。同列数据后不同小写字母表示处理间在＜0.05水平差异显著Different lowercase letters after the data in the same column indicate significantly different among treatments at＜0.05 level

2.2.2 发酵温度对粗提物抗真菌活性的影响 由图1-B可知，在设定的发酵温度范围内，随着发酵温度的升高，粗提物对辣椒疫霉的抑制率呈先上升后下降的趋势，在28 ℃时抑制率最大。发酵温度为32 ℃时抑制率急剧下降的原因可能是培养基中的水分蒸发过快，使球毛壳菌菌丝生长困难，造成球毛壳菌提前死亡。后续选择发酵温度26—32 ℃为正交试验因素水平。

2.2.3 培养基初始含水量对粗提物抗真菌活性的影响 固态发酵培养基的初始含水量对培养基中的气体交换和菌体生长具有重要作用。由图2-A可知，在设定的培养基初始含水量范围内，培养基初始含水量过高或过低都不利于球毛壳菌产生具有抗真菌活性的代谢产物。在初始含水量为80%时粗提物对辣椒疫霉的抑制率最大。后续选择培养基初始含水量70%—85%为正交试验因素水平。

2.2.4 菌液接种量对粗提物抗真菌活性的影响 由图2-B可知，在设定的菌液接种量范围内，随着菌液接种量的增加，粗提物对辣椒疫霉的抑制率呈先上升后下降的趋势，在菌液接种量为50%和62.5%时抑制率较大。此外，各菌液接种量处理间的差异不太明显，故不对其进行后续优化，后续试验的接种量确定为50%。

2.2.5 小麦秸秆粒径范围对粗提物抗真菌活性的影响 秸秆粒径大小直接影响到菌丝与秸秆的接触面积，进而影响菌丝的生长。由图3-A可知，在设定的小麦秸秆粒径范围内，随着小麦秸秆粒径目数的升高，粗提物对辣椒疫霉的抑制率总体呈上升的趋势，在100目时抑制率最大。后期将选择小麦秸秆粒径20—40、40—60、60—100、＞100目为正交试验因素水平。

柱上不同小写字母表示处理间在P＜0.05水平差异显著。下同

图2 培养基初始含水量和菌液接种量对粗提物抗真菌活性的影响

图3 小麦秸秆粒径和小麦秸秆与麦麸质量比对粗提物抗真菌活性的影响

2.2.6 小麦秸秆与麦麸质量比对粗提物抗真菌活性的影响 麦麸可以提供良好的营养物质促进微生物生长，但培养基中麦麸含量过高可能不利于微生物生产抑菌活性物质。由图3-B可知，在设定的小麦秸秆与麦麸质量比范围内，随着小麦秸秆与麦麸质量比的下降，粗提物对辣椒疫霉的抑制率总体呈下降的趋势，说明过多的麦麸不利于球毛壳菌产生抗真菌活性物质。后续选择小麦秸秆与麦麸质量比4﹕1—1﹕1为正交试验因素水平。

2.3 固态发酵条件正交优化

根据单因素试验的结果，建立了5因素4水平的正交试验因素和水平表（表1）。用L16(45)正交试验设计对球毛壳菌秸秆固态发酵产抗真菌活性物质的发酵工艺进行优化，以粗提物对辣椒疫霉的抑制率为考察指标，正交试验结果见表3，方差分析结果见表4。

在表3中，通过对各因素的R值和K值进行直观分析可知，各因素对球毛壳菌发酵粗提物抗真菌活性影响大小的主次顺序为D（小麦秸秆与麦麸质量比）＞A（发酵时间）＞C（培养基初始含水量）＞B（发酵温度）＞E（小麦秸秆粒径）；由K值大小确定球毛壳菌固态发酵产抗真菌活性物质的最优条件为A2B1C3D1E3，即发酵时间24 d、发酵温度26 ℃、培养基初始含水量80%、小麦秸秆与麦麸质量比4﹕1、小麦秸秆粒径60—100目。此外，由表4可知正交试验所优化的5个因素对球毛壳菌秸秆固态发酵粗提物抗真菌活性的影响极显著（＜0.001）。

表3 正交试验方案及结果

A：发酵时间fermentation time；B：发酵温度fermentation temperature；C：初始含水量initial water content；D：小麦秸秆与麦麸质量比mass ratio of wheat straw to wheat bran；E：秸秆粒径straw particle size。表4同The same as Table 4

表4 正交试验方差分析

2.4 正交优化结果的验证

为了验证正交试验结果，按照正交试验所得到的最优发酵条件，探讨发酵条件优化后球毛壳菌的发酵粗提物对植物病原真菌的抗菌效果是否有显著提升，重复试验3次。结果表明，在最优发酵条件，1 mg·mL-1的球毛壳菌发酵粗提物对核盘菌、辣椒疫霉、稻瘟病菌、桃褐腐病菌、尖镰孢、黄色镰孢、鞘腐霉、禾谷镰孢、水稻纹枯病菌的抑制率分别为100%、92.86%、85.94%、83.90%、76.12%、73.02%、66.18%、58.96%、52.99%，抑菌图见图4。

A—I依次为核盘菌YC-24、辣椒疫霉FU-4、稻瘟病菌R10、桃褐腐病菌F11、尖镰孢HG-5、黄色镰孢S18、鞘腐霉L99、禾谷镰孢L51、水稻纹枯病菌SDS-12的空白对照A-I are blank control pictures of S. sclerotiorum YC-24, P. capsica FU-4, M. oryzae R10, M. fructicola F11, F. oxysporum HG-5, F. culmorum S18, S. oryzae L99, F. graminearum L51, R. solani SDS-12, respectively；a—i依次为粗提物处理上述病原真菌生长的结果a-i are the treatment results of crude extracts against each pathogenic fungus

此外，如图5所示，与等浓度的对照粗提物（指仅优化培养基组成，但未优化发酵条件所获得的粗提物）相比，发酵条件优化后球毛壳菌粗提物对9种植物病原真菌的抗菌活性有不同程度的提升，其中对辣椒疫霉、稻瘟病菌、桃褐腐病菌、尖镰孢、黄色镰孢、禾谷镰孢和水稻纹枯病菌这7种病原菌抑制率的提升效果显著。在最优发酵条件下获得的粗提物对核盘菌的抑制率至少增加2.03%，对辣椒疫霉、稻瘟病菌、桃褐腐病菌、尖镰孢、黄色镰孢、鞘腐霉、禾谷镰孢、水稻纹枯病菌的抑制率分别增加了15.81%、13.26%、12.60%、12.88%、10.86%、4.89%、9.81%、10.13%。

3 讨论

3.1 培养基组成对球毛壳菌固态发酵粗提物抗真菌活性的影响

选择合适的发酵培养基和发酵条件是固态发酵的关键因素，因为其对微生物代谢产物的种类和产量有重要影响。据报道，球毛壳菌W7在玉米秸秆和氯化铵组成的培养基中进行固态发酵可产生球毛壳菌素A，该物质对拟分枝镰孢（）和立枯丝核菌的抑制效果显著[11-12]。球毛壳菌CGMCC 6882在仅含有小麦秸秆的液体培养基中可产生一种具有抗氧化和抗菌活性的多糖，在含有水稻秸秆和其他多种营养物质的液体培养基中可产生球毛壳菌素A[13-15]。前人的研究说明，球毛壳菌利用农业废弃物秸秆产生具有生物活性的物质是可行的，同时球毛壳菌能产生不同的活性物质，其原因可能是不同培养基成分和培养状态下激活了球毛壳菌的某些沉默基因簇。本试验在前人研究基础上对培养基的组成进行优化，并发现小麦秸秆和麦麸组成的培养基有利于球毛壳菌产生具有抗真菌活性的物质。PAN等[21]利用PDB培养基对球毛壳菌28进行培养，所获得的粗提物（1 mg·mL-1）对核盘菌、尖镰孢、辣椒疫霉和禾谷镰孢的抑菌率分别为59.66%、61.68%、64.90%和59.06%；KUMAR等[22]使用MPG液态培养基对球毛壳菌EF-18进行发酵，所得粗提物（0.5 mg·mL-1）对核盘菌的抑制率为70.08%；LIU等[23]也利用PDB培养基对球毛壳菌LB-2进行培养，所得粗提物（1 mg·mL-1）对尖镰孢的抑制率为70.08%。本研究利用小麦秸秆和麦麸组成的秸秆固态培养基对球毛壳菌DX-THS3进行发酵，所得粗提物的抗菌活性较高，不逊于常见的PDB培养基发酵。值得注意的是，本研究的粗提物（1 mg·mL-1）对核盘菌和辣椒疫霉的抑制率分别为100%和92.86%，显著高于球毛壳菌在PDB培养基中发酵所得粗提物的抑制率。因此，球毛壳菌可利用小麦秸秆生产抗真菌活性物质，对秸秆进行绿色资源化利用。

CK：仅优化培养基组成，但未优化发酵条件所获得的粗提物the crude extract obtained by optimizing the medium composition, but not the fermentation conditions；PT：优化培养基组成和发酵条件后所获得的粗提物the crude extract obtained after optimizing medium composition and fermentation conditions。*：同一植物病原真菌的PT与CK相比在P＜0.05水平差异显著PT and CK of the same plant pathogen fungus are significantly different at P＜0.05 level。SS：核盘菌YC-24 S. sclerotiorum YC-24；PC：辣椒疫霉FU-4 P. capsica FU-4；MO：稻瘟病菌R10 M. oryzae R10；MF：桃褐腐病菌F11 M. fructicola F11；FO：尖镰孢HG-5 F. oxysporum HG-5；FC：黄色镰孢S18 F. culmorum S18；SO：鞘腐霉L99 S. oryzae L99；FG：禾谷镰孢L51 F. graminearum L51；RS：水稻纹枯病菌SDS-12 R. solani SDS-12

3.2 发酵条件对球毛壳菌固态发酵粗提物抗真菌活性的影响

在确定最优培养基组成后，有必要进行发酵条件的优化。温度能直接影响微生物源蛋白酶及纤维素酶活性，从而间接影响发酵效果[24]。前人报道球毛壳菌的最适生长温度为25 ℃，最高生长温度为39 ℃[25]。本研究优化所得的最优温度为26 ℃，与姜成[11]所优化的产球毛壳菌素A的温度25.45 ℃接近。培养基含水量是影响微生物活性的重要因素，也是固态发酵时必须要考量的发酵条件。Gao等[5]研究表明，75%的含水量是球毛壳菌产生甘草次酸3--单---葡萄糖醛酸的最优含水量。而本研究发现，培养基的初始含水量为80%有利于球毛壳菌抗真菌物质的产生。因为含水量太高，会使培养基空隙空间充满水，空气被排出，进而形成缺氧环境[26]；而水分含量太低会限制养分的溶解度，阻碍微生物的发育[20]。发酵基质的粒径在固态发酵中有举足轻重的地位，本研究结果表明，小麦秸秆的最优粒径为60—100目。虽然较小的秸秆颗粒可以为微生物附着提供较大的表面积，但也会导致秸秆颗粒团聚，从而影响氧气转移，阻碍微生物的发育[20]。另外，大粒径秸秆能使培养基通气效率提高，但却限制着微生物附着的表面积[27-28]。麦麸营养成分丰富主要包括粗蛋白质、淀粉、粗脂肪和粗纤维等[29]。本研究结果表明，球毛壳菌发酵粗提物的抗真菌活性与麦麸的添加量呈负相关，这与孙佳静等的研究结果类似[30]，其原因可能在于麦麸纤维含量高[29]，过多添加会反而不利于球毛壳菌的正常生长。此外，接种量对球毛壳菌固态发酵粗提物抗真菌活性的影响不显著，这可能是因为随着发酵时间的延长，各接种量最终都会到达基质容量内的最大微生物量[24]。

后续可利用本研究建立的发酵工艺进行大规模发酵，借助天然产物分离手段对球毛壳菌发酵产物进行分离、纯化，以明确抗真菌物质的结构与类型，并进一步探讨抗真菌物质拮抗植物病原真菌的作用机制。此外，有研究表明，球毛壳菌ND35接种于麦粒上制成的菌肥能促进杨树、板栗和核桃幼苗的生长[31-33]，球毛壳菌D38在麦麸和棉籽壳的混合物中发酵制得的菌肥可以极大地促进丹参的生长，并提高丹参的丹酚酸和丹参酮产量[34]，因此利用该发酵工艺或许可以制备出一种具有良好促生作用的球毛壳菌菌肥。

4 结论

利用球毛壳菌DX-THS3对秸秆进行固态发酵，其发酵粗提物有较好的抗植物病原真菌活性，进而对其培养基组成及发酵条件进行了一系列的优化。培养基的最优组成为小麦秸秆和麦麸，且在发酵时间为24 d、发酵温度为26 ℃、培养基初始含水量为80%、小麦秸秆与麦麸质量比为4﹕1、小麦秸秆粒径为60—100目的发酵条件下，球毛壳菌发酵粗提物的抗真菌活性最高。研究结果可为球毛壳菌生物农药的开发及秸秆绿色资源化利用提供参考。

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Optimization of solid state fermentation for production of active substances against plant pathogenic fungi from

LIAO HongJuan1, JIANG YuMei, YE Xia1, ZHANG ZhiBin1, MA TongYu1, ZHU Du

1College of Life Sciences, Jiangxi Normal University/Key Laboratory of Protection and Utilization of Subtropic Plant Resources of Jiangxi Province, Nanchang 330022;2College of Life Sciences, Jiangxi Science and Technology Normal University/Key Laboratory of Bioprocess Engineering of Jiangxi Province, Nanchang 330013

【Objective】The objective of this study is to optimize the medium composition and fermentation conditions of straw solid-state fermentation of, improve the antifungal activity of fermentation crude extract, and to provide references for the development of biopesticides ofand the green resource utilization of straw.【Method】Firstly, using the inhibition rate of crude extracts against the mycelia growth of 9 plant pathogenic fungi as evaluation index, straw (rice, wheat, maize, rape) and nitrogen source (bean pulp, wheat bran, ammonium chloride) in the medium were screened to determine the optimal composition of fermentation medium. Then the single factor optimization of fermentation conditions was carried out, and the inhibition rate of crude extracts againstwas taken as the evaluation index to determine the optimal range of each fermentation condition and the degree of influence on the antifungal activity of crude extracts. Based on the results of single factor optimization, orthogonal design was used to optimize the fermentation conditions. Parameters were as follows: fermentation time 18-36 d, fermentation temperature 26-32 ℃, initial water content of medium 70%-85%, mass ratio of straw to wheat bran 4﹕1-1﹕1, straw particle size 20-＞100 mesh. Finally, the optimal fermentation conditions for producing antifungal active substances by solid state fermentation of straw fromwere obtained and verified.【Result】When the composition of solid fermentation medium was screened, it was found that the antifungal effect of crude extracts obtained from the medium composed of wheat straw and wheat bran was generally better than that of other medium. In the single factor optimization of fermentation conditions, the inoculation amount of fungal solution had no significant effect on the antifungal effect of crude extract, so the subsequent orthogonal optimization was not carried out. In the orthogonal optimization, the effects of fermentation conditions on the antifungal activity of the crude extracts were extremely significant (＜0.001), and the effects were as follows: mass ratio of wheat straw to wheat bran＞fermentation time＞initial water content of medium＞fermentation temperature＞particle size of wheat straw. The optimal fermentation conditions obtained by orthogonal optimization were as follows: fermentation time 24 d, fermentation temperature 26 ℃, initial water content of medium 80%, mass ratio of wheat straw to wheat bran 4﹕1, particle size of wheat straw 60-100 mesh. After optimization of fermentation conditions, the inhibitory rates of 1 mg·mL-1crude extract from the fermentation ofagainst,,,,,,,andwere 100%, 92.86%, 85.94%, 83.90%, 76.12%, 73.02%, 66.18%, 58.96% and 52.99%, respectively.【Conclusion】After the optimization of fermentation medium composition and fermentation conditions, the crude extracts ofhad high antifungal activity, which could lay a foundation for the subsequent separation and purification of antifungal active substances produced by straw solid fermentation of

; straw; plant pathogenic fungi; solid state fermentation; antifungal activity

2023-02-27；

2023-04-11

国家自然科学基金（31760161）、江西省自然科学基金（20202BABL203048）、江西省教育厅项目（GJJ160314）

廖宏娟，E-mail：1774149530@qq.com。通信作者江玉梅，E-mail：leaf91626@163.com。通信作者朱笃，E-mail：zhudu12@163.com

10.3864/j.issn.0578-1752.2023.11.006

（责任编辑 岳梅）