优化止咳祛痰糖浆中盐酸麻黄碱含量测定方法

刘竞 刘东升 朱旭江 王兰霞

【摘 要】

目的：补充和完善止咳祛痰糖浆质量标准。方法：采用HPLC法测定盐酸麻黄碱含量：以日立HITACHI HPLC column （4.6 mm×250 mm，5 μm）为色谱柱，甲醇-0.03 mol/L磷酸二氢钾溶液-三乙胺（10∶90∶0.02）为流动相，流速：1.0 mL/min，进样量：10 μL，检测波长为205 nm。结果：盐酸麻黄碱在相应范围内线性关系良好，平均回收率为100.2%（RSD<3%）。结论：优化的方法简便、准确，符合质量标准制定的要求，该研究方法可为其质量控制提供参考。

【关键词】

止咳祛痰糖浆；HPLC；盐酸麻黄碱

【中图分类号】R284.1   【文献标志码】 A    【文章编号】1007-8517（2023）06-0042-04

Optimization of Extraction Method of Ephedrine Hydrochloride and Antitussive Syrup

LIU Jing1 LIU Dongsheng2 ZHU Xujiang2 WANG Lanxia1*

1.Gansu University of Chinese Medicine，Lanzhou 730000，China;

2.Gansu Institute for Drug Control， Lanzhou 730070，China

Abstract：

Objective To supplement and improve the quality standard of cough relieving and expectorant syrup. Methods The content of ephedrine hydrochloride was determined by HPLC method： Hitachi HITACHIHPLCcolumn （4.6 mm×250 mm， 5 μm） was used as chromatographic column， methanol-0.03 mol/L potassium dihydrogen phosphate solution-triethylamine （10∶90∶0.02） as mobile phase， flow rate： 1.0 mL/min， injection volume： 10 μL， detection wavelength was 205 nm. Results Ephedrine hydrochloride had a good linear relationship in the corresponding range， and the average recovery was 100.2% （RSD<3%）. Conclusion The optimization method is simple， accurate and meets the requirements of quality standard. this research method can provide reference for its quality control.

Keywords：

Cough and Expectorant Syrup; HPLC; Ephedrine Hydrochloride

止咳祛痰糖漿是由桔梗、百部及苦杏仁三味药材经煎煮、浓缩为清膏，后加入盐酸麻黄碱加工而成，其功效是润肺祛痰，止咳定喘［1］。用于伤风咳嗽、慢性支气管炎及支气管哮喘。现行标准为国家药品标准［WS-10036（ZD-0036）-2002-2012Z］，标准中收载性状、薄层鉴别（盐酸麻黄碱、桔梗）和盐酸麻黄碱的含量测定，但在检验过程中发现盐酸麻黄碱的实际投料和盐酸麻黄碱的含量测定值存在差异，可能由于供试品溶液制备过程中提取过程过于复杂以及溶液挥干过程中盐酸麻黄碱损失造成。基于以上原因补充了盐酸麻黄碱含量测定方法，以期完善止咳祛痰糖浆的质量标准。

1 试验材料

1.1 仪器 Waters alliance e2695型高效液相色谱仪；e2695 HPLC Pump、2998 DuaLλ Absorbance Detector 和Empower色谱工作站；日立HITACHI HPLC column （4.6 mm×250 mm，5 μm）色谱柱；METTLER TOLEDO ME204（万分之一）；METTLER TOLEDO MS205DU（十万分之一）和XPE 26（百万分之一）型分析天平（梅特勒-托利多）。

1.2 试剂与试药 盐酸麻黄碱（批号：171241-201508，含量：99.8%）对照品由中国食品药品检定研究院提供。止咳祛痰糖浆样品为A公司生产，批号为：2001056001、2001057001、2001058001、2003056001、2003057001、2003058001、2003060001、2006056001。甲醇、乙腈为色谱纯，水为超纯水，其它试剂均为分析纯。

2 实验方法与结果

2.1 色谱条件 色谱柱选用日立HITACHI HPLC column（4.6mm×250 mm，5 μm），以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-0.03 mol/L磷酸二氢钾溶液-三乙胺（10∶90∶0.02）为流动相，检测波长为205 nm，流速为1.0 mL/min，进样量为10 μL。

2.2 溶液制备

2.2.1 供试品溶液制备 精密量取样品2 mL置25 mL量瓶中，加稀乙醇溶液稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.2.2 对照品溶液制备 精密称取盐酸麻黄碱对照品22.02 mg，置25 mL量瓶中，加稀乙醇溶液至刻线，摇匀，精密量取3 mL，置50 mL量瓶中，加稀乙醇溶液至刻线，摇匀，即得。

2.2.3 阴性溶液制备 按处方比例及制备工艺，配制不含盐酸麻黄碱的阴性样品，并按“2.2.1”项下供试品溶液制备方法制成阴性对照液。

2.3 方法学验证

2.3.1 专属性考察 取盐酸麻黄碱对照品溶液、供试品溶液及缺盐酸麻黄碱的阴性样品适量，0.45 μm微孔滤膜过滤，各精密吸取10 μL，按“2.1”项下色谱条件进行测样，结果如图1。实验结果表明阴性色谱图中在与盐酸麻黄碱相应的保留时间没有色谱峰，说明其他药材及溶剂对盐酸麻黄碱的测定无干扰，以本法测定止咳祛痰糖浆中盐酸麻黄碱的含量具有专属性。

2.3.2 标准曲线 精密吸取对照品溶液3 μL、5 μL、10 μL、20 μL、30 μL、40 μL，注入液相色谱仪，按“2.1”项下色谱条件进行测定峰面积积分值，以对照品溶液的进样量为横坐标（X），峰面积积分值为纵坐标（Y）作图，绘制标准曲线，计算回归方程，得到盐酸麻黄碱的回归方程为Y=2402.6X-9512.6，相关系数r=0.9999；表明盐酸麻黄碱在158.544～2113.92 μg范围内进样量与峰面积线性关系良好。

2.3.3 精密度試验 精密吸取盐酸麻黄碱对照品溶液10 μL，按“2.1”项下色谱条件注入液相色谱仪，连续进样6次，记录峰面积，测定结果经计算，RSD为1.12%，表明仪器精密度良好。

2.3.4 重复性试验 取同一批号的样品（批号：2001056001），按照“2.2.1”项下制备供试品溶液6份，精密吸取供试品溶液10 μL，注入液相色谱仪，按“2.1”项下色谱条件平行测定，并计算样品中待测成分的含量。结果含量平均值为0.58 mg/mL，RSD为1.62%，表明该分析方法重复性良好。

2.3.5 稳定性试验 精密吸取同一批号（批号：2001056001）供试品溶液10 μL，注入液相色谱仪，按“2.1”项下色谱条件进行测定，分别在0 h、4 h、16 h、24 h、30 h、36 h进样，测定供试品溶液中盐酸麻黄碱的峰面积。实验结果显示36 h内盐酸麻黄碱峰面积的RSD为1.29%，说明供试品溶液在36 h内稳定可测。

2.3.6 加样回收率试验 精密量取样品（批号：2001056001）1 mL、对照品溶液1 mL（盐酸麻黄碱0.7206 mg）置25 mL量瓶中，加稀乙醇溶液稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，平行操作6份，按“2.1”项下色谱条件测定含量，计算加样回收率，结果盐酸麻黄碱的平均加样回收率分别为100.4%，RSD=2.99%（n=6），根据中国药典2020年版“药品质量标准分析方法验证指导原则”规定样品中待测成分含量在0.01%～0.10%时，回收率限度为90%～108%，表明回收率良好。结果见表1。

2.3.7 样品测定 依法制备供试品溶液并按照“2.1”项下色谱条件，对8批样品进行了测定，结果见表2。

2.4 单因素方差分析 为探究止咳祛痰糖浆两种提取方法的盐酸麻黄碱含量变化是否有显著性差异，采用单因素方差分析法［3-4］对HPLC法检测得到的盐酸麻黄碱数据进行分析。运用 SPSS Statistics 22.0对原标准提取方法（A），优化后提取方法（B）进行方差分析，结果见表3。

通过对止咳祛痰糖浆中盐酸麻黄碱含量进行单因素方差分析，由上表可知：盐酸麻黄碱的含量在A提取方法和B提取方法两组的比较中存在显著性差异，具有统计学意义（P=0.04＜0.05），且B提取方法的含量大于A提取方法。

3 讨论

3.1 测定波长考察 取“2.2”项下盐酸麻黄碱对照品的单标溶液，在190到400 nm之间进行扫描，测得光谱图。从图谱可以看出盐酸麻黄碱在205 nm处有最大吸收。参照《中国药典》［5］2020年版一部麻黄（检测波长为210 nm）、镇咳宁糖浆（检测波长为205 nm）、鼻炎通喷雾剂（检测波长为213 nm）和原方法中的检测波长215 nm分别进行，实验结果发现当盐酸麻黄碱的检测波长为205 nm时，对照品和样品都能得到较好的色谱峰，能够减少溶剂对实验结果的影响。

3.2 峰纯度考察 取止咳祛痰糖浆“2.2”项下供试品溶液、盐酸麻黄碱对照品溶液10～20 μL，注入液相色谱仪，按“2.1”项下色谱条件以DAD检测器进行190～400 nm扫描检测，计算峰纯度。

峰纯度实验结果表明，样品中盐酸麻黄碱峰未检测到杂质峰，纯度因子在计算出的阈值限值内，说明在该色谱条件下，盐酸麻黄碱纯度符合要求。

3.3 提取溶剂的选择 提取方法修订主要参照《中国药典》2020版一部［5］麻黄和镇咳宁糖浆含量测定项下及相关文献［6-13］报道中的盐酸麻黄碱的含量测定方法，精密吸取一定量的样品加稀乙醇或者原方法中加流动相（0.03 mol/L磷酸二氢钾溶液）分别进行稀释实验；结果发现相对于原方法中加流动相（0.03 mol/L磷酸二氢钾溶液）稀释液，选用稀乙醇对样品进行稀释后，供试品溶液色谱图中杂峰相对减少且基线更加平稳，而不同稀释溶液稀释后色谱峰的峰面积相同。所以将供试品溶液的提取过程最终修订为“精密量取本品2 mL置25 mL量瓶中，加稀乙醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得”。

3.4不同色谱柱考察 为了考察该含量测定方法的耐用性，精密吸取同一批号（批号：2001056001）的供试品溶液10 μL，注入液相色谱仪，除色谱柱分别改为资生堂SHISEIDO CAPCELL PAK C18 MG（250×4.6 mm，5 μm）、费罗门Phenomenex Gemini（250mm×4.6 mm，5 μm）、泰克美（250 mm×4.6 mm，5 μm）和安捷伦 Agilent HC C18（2）（250 mm×4.6 mm，5 μm）外，其他条件按“2.3”项下色谱条件进样分析，测定样品中盐酸麻黄碱的含量。实验结果：比较不同色谱柱的分离效果及含量值，各色谱柱分离效果良好，含量RSD为1.57%，表明该分析方法在不同色谱柱下分析耐用性较好。

3.5 不同柱温考察 精密吸取供试品溶液10 μL，注入液相色谱仪，除柱温分别改为25 ℃、30 ℃、35 ℃外，其他条件按“2.1”项下色谱条件进样分析，测定样品中盐酸麻黄碱的含量。实验结果：比较三种不同柱温（±5 ℃）的盐酸麻黄碱的含量值，含量RSD为2.37%，表明该分析方法在柱温±5℃范围内耐用性良好，能适应柱温微小的变动。

3.6 不同流速考察 精密吸取供试品溶液10 μL，注入液相色谱仪，除流速分别改为0.9 mL/min、1.0 mL/min和1.1 mL/min外，其他条件按“2.1”项下色谱条件进样分析，测定样品中盐酸麻黄碱的含量。实验结果：比较三种不同流速（±0.2 mL/min）的盐酸麻黄碱的含量值，含量RSD为1.58%，表明该分析方法在流速±0.2 mL/min范围内耐用性良好，能适应流速微小的变动，方法耐用性较好。

3.7 不同流动相比例考察 精密吸取供试品溶液10 μL，注入液相色谱仪，除流动相比例分别改为甲醇-0.03 mol/L磷酸二氢钾溶液-三乙胺（12∶88∶0.02）、甲醇-0.03 mol/L磷酸二氢钾溶液-三乙胺（10∶90∶0.02）和甲醇-0.03 mol/L磷酸二氢钾溶液-三乙胺（8∶92∶0.02）外，其他条件按“2.1”项下色谱条件进样分析，测定样品中盐酸麻黄碱的含量，RSD为2.14%。说明该分析方法能适应流动相甲醇、0.03 mol/L磷酸二氢钾溶液比例的微小变动，方法耐用性较好。

3.8 差异性分析 通过对A方法和B方法进行单因素方差分析得出两种方法具有显著性差异，并且B方法测得含量大于A方法。B方法测得盐酸麻黄碱的含量更接近实际投料值，说明厂家按处方投料，造成差异的原因是A方法可能是制备供试品溶液过程中过于复杂，在萃取、转移等操作中造成盐酸麻黄碱损失。而新建立的提取方法，操作方便快捷，也不会造成盐酸麻黄碱的损失，使得止咳祛痰糖浆的标准更加完善。

综上所述，本研究所建立的HPLC法测定止咳祛痰糖浆中盐酸麻黄碱含量测定方法，经过方法学验证，简便、准确度高、重复性好、耐用性强，为止咳祛痰糖浆质量控制提供了科学依据。

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（收稿日期：2022-08-09 编辑：刘 斌）