柴芍理气和胃合剂质量标准研究*

刘信秋，李思光，尹安坤，牛海军，李晓亮，刘旭东，袁如柏△

（1. 安徽省亳州市中医院，安徽亳州 236800； 2. 安徽九方药物研究院有限公司，安徽合肥 230088；3. 安徽省亳州市蒙城县中医院，安徽亳州 233500）

肝气犯胃型胃脘痛以上腹部胃脘近心窝处疼痛为主要表现［1］，情绪宣泄不畅以致积聚成郁气是其主要病因。西医对于胃痛多采取对症治疗，远期疗效欠佳［2］，而中医治疗胃脘痛历史悠久且效果显著，故可考虑结合中医治疗［3-5］。柴芍理气和胃合剂是我院临床验方，常用于胃痛的治疗。为建立其较准确、较全面的质量标准，保证临床疗效。本研究中采用薄层色谱（TLC）法对制剂中柴胡、麸炒枳壳、黄芩、浙贝母进行定性鉴别，采用高效液相色谱（HPLC）法测定芍药苷的含量。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Thermo U - 3000 型高效液相色谱仪（美国Thermo Fisher Scientific 公司）；SQP 型电子天平（德国Sartorius公司，精度为0.01 mg）；ZF - 7N 型智能暗箱式三用紫外分析仪（上海嘉鹏科技有限公司）；KQ - 100DE 型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；硅胶G薄层板（青岛谱科分离材料有限公司）。

1.2 试药

柴芍理气和胃合剂（蒙城县中医院制剂室自制，16味组方中药饮片均购于安徽普仁中药饮片有限公司，并经亳州市中医院袁如柏副主任中药师鉴定均为正品；批号分别为20210501，20210502，20210503，规格为每瓶250 mL）；柴胡、枳壳、浙贝母的对照药材（批号分别为120992 - 201509，120981 - 201605，120972 -201906），黄芩苷、芍药苷的对照品（批号分别为110715-201821，110736-201943，含量均大于95%），均购于中国食品药品检定研究院；乙腈为色谱纯，其余试剂均为分析纯，水为纯化水。

2 方法与结果

2.1 TLC 鉴别

柴胡：取样品10 mL，加水饱和正丁醇溶液振摇萃取2 次，每次15 mL，合并正丁醇液，依次用等体积的氨试液和正丁醇饱和的水洗涤，弃去水层，正丁醇液蒸干，加甲醇1 mL 使残渣溶解，作为供试品溶液；取柴胡对照药材0.5 g，加水40 mL，加热回流1 h，滤过，取滤液，按供试品溶液制备方法制备对照药材溶液；按柴芍理气和胃合剂处方及工艺制备不含柴胡的阴性样品，同供试品溶液制备方法制备阴性对照品溶液。取上述溶液各5 μL，分别点于同一硅胶G 薄层板上，以水-甲醇-三氯甲烷（2∶7∶13，V/V/V）10 ℃下静置分层后的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以含2%对甲氨基苯甲醛的40%硫酸乙醇溶液，70 ℃加热至斑点清晰，置紫外光灯（365 nm）下检视［6-7］。供试品溶液色谱中，在与对照药材溶液色谱相应位置显相同颜色的斑点，阴性对照无干扰。详见图1 A。

图1 薄层色谱图1.Negative reference solution 2.Reference solution of medicinal materials 3.Reference solution 4-6.Test solution A.Bupleuri Radix B.Bran-Fried Aurantii Fructus C.Scutellariae Radix D.Fritillariae Thunbergii BulbusFig.1 TLC chromatograms

麸炒枳壳：取样品20 mL，加乙酸乙酯振摇萃取2次，每次20 mL，合并乙酸乙酯，水浴蒸干，加甲醇1 mL使残渣溶解，作为供试品溶液；取枳壳对照药材0.2 g，加甲醇15 mL，超声（功率100 W、频率40 kHz，下同）处理30 min，滤过，滤液蒸干，加甲醇2 mL 使残渣溶解，作为对照药材溶液；按柴芍理气和胃合剂处方及工艺制备不含麸炒枳壳的阴性样品，同供试品溶液制备方法制备阴性对照品溶液。取上述溶液各2 μL，分别点于同一硅胶G 薄层板上，以水- 甲醇- 三氯甲烷（2∶7∶13，V/V/V）静置分层后的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以2%三氯化铝乙醇溶液，105 ℃加热约5 min，置紫外光灯（365 nm）下检视［6，8-9］。供试品溶液色谱中，在与对照药材溶液色谱相应位置显相同颜色的斑点，阴性对照无干扰。详见图1 B。

黄芩：取样品1 mL，加水稀释至10 mL，加盐酸调pH 至2，加乙酸乙酯振摇萃取2 次，每次15 mL，合并乙酸乙酯，水浴蒸干，加甲醇2 mL 使残渣溶解，作为供试品溶液；取黄芩苷对照品适量，加甲醇制成质量浓度为1 mg/mL 的溶液，作为对照品溶液；按柴芍理气和胃合剂处方及工艺制备不含黄芩的阴性样品，同供试品溶液制备方法制备阴性对照品溶液。取上述溶液各5 μL，分别点于同一硅胶G 薄层板上，以水- 甲酸- 丙酮-乙酸丁酯（1∶1∶3∶5，V/V/V/V）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以2%三氯化铁乙醇溶液，置日光灯下检视［6，10］。供试品溶液色谱中，在与对照品溶液色谱相应位置显相同颜色的斑点，阴性对照无干扰。详见图1 C。

浙贝母：取样品20 mL，加浓氨试液2 mL，加三氯甲烷振摇萃取2次，每次20 mL，合并三氯甲烷萃取液，水浴蒸干，加甲醇1 mL 使残渣溶解，作为供试品溶液；取浙贝母对照药材2.0 g，加浓氨试液2 mL，加三氯甲烷20 mL，超声处理20 min，放冷，滤过，滤液水浴蒸干，加甲醇1 mL 使残渣溶解，作为对照药材溶液；按柴芍理气和胃合剂处方及工艺制备不含浙贝母的阴性样品，同供试品溶液制备方法制备阴性对照品溶液。取上述溶液各5 μL，分别点于同一硅胶G 薄层板上，以甲醇-浓氨试液-乙酸乙酯（2∶1∶17，V/V/V）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以稀碘化铋钾试液，置日光灯下检视［6，11-12］。供试品溶液色谱中，在与对照药材溶液色谱相应位置显相同颜色的斑点，阴性对照无干扰。详见图1 D。

2.2 芍药苷含量测定［6］

2.2.1 色谱条件

色谱柱：Thermo Syncronis C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈（A）-0.2%磷酸水溶液（B），梯度洗脱（0～30 min时12%A→40%A，30～30.1 min时40%A→12%A，30.1～35 min 时12%A）；流速：1.0 mL/ min；检测波长：230 nm；柱温：30 ℃；进样量：5 μL［13-17］。

2.2.2 溶液制备

取芍药苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成质量浓度为59.2 μg/mL的对照品溶液。精密量取样品2 mL，置25 mL容量瓶中，加乙醇稀释，定容，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。按柴芍理气和胃合剂处方及工艺制备缺白芍的阴性样品，再按供试品溶液制备方法制得阴性对照品溶液。

2.2.3 方法学考察

专属性试验与系统适用性试验：分别吸取2.2.2项下3 种溶液各5 μL，按2.2.1 项下色谱条件进样测定，记录色谱图。结果供试品溶液色谱中，在与对照品溶液色谱相同保留时间处显相同色谱峰，且阴性对照无干扰，表明方法专属性良好。理论板数按芍药苷峰计应不低于2 000，分离度为8.08，拖尾因子为1.01。详见图2。

线性关系考察：精密量取已知质量浓度（0.0592mg/mL）的芍药苷对照品溶液各适量，加乙醇制成质量浓度分别为0.008 4，0.016 9，0.033 8，0.067 6，0.168 9 mg/mL的系列对照品溶液。按2.2.1 项下色谱条件进样测定，记录峰面积。以芍药苷质量浓度（X，mg/mL）为横坐标、峰面积（Y）为纵坐标进行线性回归，得回归方程Y=129.13X-0.071（R2=0.999 0，n=5）。结果表明，芍药苷质量浓度在0.008 4～0.168 9 mg/mL 范围内与峰面积线性关系良好。

精密度试验：精密量取质量浓度为0.059 2 mg/mL的对照品溶液5 μL，按2.2.1项下色谱条件连续进样测定6次，记录峰面积。结果的RSD为0.31%（n=6），表明仪器精密度良好。

稳定性试验：精密量取样品（批号20210501）2 mL，按2.2.2项下方法制备供试品溶液，分别于室温下放置0，2，4，8，12，24 h 时按2.2.1 项下色谱条件进样测定，记录峰面积。结果的RSD为0.96%（n=6），表明供试品溶液在室温下放置24 h内基本稳定。

重复性试验：精密量取样品（批号20210501）适量，平行6份，按2.2.2项下方法制备供试品溶液，按2.2.1项下色谱条件进样测定，记录峰面积并计算含量。结果芍药苷含量的RSD为0.22%（n=6），表明方法重复性良好。

加样回收试验：精密量取已知含量的样品（批号20210501），共6 份，每份1 mL，精密加入芍药苷对照品适量，按2.2.2 项下方法制备供试品溶液，按2.2.1 项下色谱条件进样测定，记录峰面积，并计算加样回收率。结果见表1。

表1 加样回收试验结果（n=6）Tab.1 Results of the recovery test（n=6）

2.2.4 样品含量测定及限度确定

取投料的3 批次白芍药材饮片和3 批样品适量，分别按2.2.2 项下方法制备供试品溶液，按2.2.1 项下色谱条件进样测定，记录峰面积，并计算芍药苷含量及转移率。结果见表2。柴芍理气和胃合剂成品最低含量范围为0.334 9～0.338 5 mg/mL，考虑到生产实际，并保证临床疗效，芍药苷最低含量限度定为0.35 mg/mL。

表2 样品含量及转移率Tab.2 Results of content and transfer rate of paeoniflorin in samples

3 讨论

3.1 方解

柴芍理气和胃合剂由柴胡、白芍、醋香附、麸炒枳壳、槟榔、黄芪等16味中药材组方。方中柴胡疏肝解郁，白芍柔肝止痛，共为君药；香附疏肝、行气、止痛、解郁，麸炒枳壳、槟榔理气行滞，黄芪、山药补脾益气，白术、薏苡仁健脾燥湿，共为臣药；姜半夏降逆止呕、燥湿化痰、消痞散结，白及收敛止血，黄芩清肝热燥湿，煅瓦楞子消痰化瘀、软坚散结、止酸止痛，浙贝母清热化痰散结，徐长卿止痛消肿，均为佐药；甘草调和诸药，为使药。诸药合用，共奏疏肝理气、活血止痛及止酸止血之功。

3.2 TLC 条件优化

预试验中，曾对处方中除白芍和煅瓦楞子外的14味药材进行了研究，考察了不同的提取方法、展开剂、薄层板及显色剂对TLC 鉴别结果的影响，排除了专属性、耐用性不好的鉴别项，最终将柴胡、麸炒枳壳、黄芩及浙贝母4种药材的TLC 鉴别纳入质量标准的考察范围。煅瓦楞子的主要成分为碳酸钙，目前相关文献对复方制剂中碳酸钙的定性鉴别研究较少，唐蕾等［18］采用离子色谱法，通过测定制剂中钙元素的含量，推算出瓦楞子含量，该方法可为柴芍理气和胃合剂中煅瓦楞子含量的测定提供参考。

3.3 HPLC 条件优化

预试验中，在210～400 nm 波长范围内对芍药苷样品进行测定，结果在231 nm 波长处有最大吸收，因此本研究的测定波长确定为230 nm。在确定定量检测指标时，首先选择君药（柴胡、白芍）中的有效成分作为检测指标，但由于柴胡药材定量成分（柴胡皂苷a和柴胡皂苷d）含量限度较低，故本研究选择目标成分单一、稳定，且含量相对较高的芍药苷作为定量检测指标；药理学研究表明，芍药苷具有抗抑郁、镇痛、保肝、调节免疫等作用［19］，这与柴芍理气和胃合剂疏肝理气、活血止痛的关键功效有较强关联；芍药苷为白芍中的有效成分，梅茜等［20］分析预测芍药苷可作为白芍的质量标志物，作为复方制剂质量标准控制的指标成分，其含量能客观反映白芍药材及含有白芍的复方制剂质量的优劣。基于以上三点，选择芍药苷作为定量测定指标。

在耐用性试验中，考察了Thermo Syncronis C18柱，Wonda Cract ODS - 2 柱，Hypersil ODS2 柱（规格均为250 mm × 4.6 mm，5 μm）3 种品牌色谱柱，结果在色谱峰面积、理论板数、分离度及拖尾因子方面均能满足耐用性要求，表明色谱柱的改变对结果无明显影响。

本研究中测定了投料的3 批次白芍药材饮片中芍药苷的含量，结果相差甚微，表明其含量较稳定，有利于从投料源头对制剂进行质量控制；制成制剂后，芍药苷转移率波动较小，说明制剂制备工艺较稳定。

3.4 方法评价

制剂质量是保障临床有效性的关键，柴芍理气和胃合剂组方药材多、成分复杂，故确立评价制剂质量的多指标综合评价体系有一定意义。本研究中在保障可操作性的基础上，分别建立了柴胡、麸炒枳壳、黄芩、浙贝母的TLC 鉴别法及芍药苷的HPLC 含量测定法，简单易行、结果重复性较好，可用于柴芍理气和胃合剂的质量控制。