十二烷基苯磺酸钠暴露对黄颡鱼稚鱼的遗传毒性

田海军，任胜杰，杨铁柱，杨治国

（1.信阳农林学院水产学院，河南 信阳 464000；2.盐城工学院海洋与生物工程学院，江苏 盐城 224051）

十二烷基苯磺酸钠（SDBS）因其高效去污性能，较强耐酸碱能力，不受水中的钙、镁等离子影响，分散、抗静电性能优良[1-3]，被广泛应用于工业、农业及日常生活中，随工农业生产废水和日常生活污水持续大量地排入水体环境。SDBS 在水环境中自然降解速度慢，且易在水面形成大量积聚不散的泡沫层，影响水体的氧气交换，使水质恶化，产生生物毒性[4-6]。近年来对凡纳滨对虾（Litopenaeus νannamei）[7]、安氏伪镖水蚤（Pseudodiaptomus annandalei）[8]、黄河鲤（Cyprinus carpio）[9]、褐点石斑鱼（Epinephelus fuscoguttatus）[10]、刺参（Apostichopus japonicus）[11]、双小核草履虫（Paramecium primaurelia）[12]、中华倒刺鲃（Spinibarbus sinensis）[13]、尼罗罗非鱼（Oreochromis niloticus）[14]等水生动物开展了SDBS的毒性研究，主要集中于SDBS 的急性毒性及高浓度条件下的生理生化的影响，然而实际环境相关浓度下的SDBS对鱼类的亚急性毒性效应尤其是遗传毒性相关研究报道则较少。

鱼类尤其是稚鱼对水环境变化较为敏感。水环境中残留的有害物质通常会导致鱼类血细胞发生异常，如细胞核的染色体发生畸变，形成微核现象[15-20]。水体有机污染物长期对鱼类的暴露可能会诱发DNA 氧化损伤[21-26]，研究表明阴离子表面活性剂十二烷基硫酸钠对草鱼的暴露会造成氧化损伤[27]。且在所有DNA 核碱基中鸟苷最易被氧化生成8-羟基脱氧鸟苷（8-OHdG），因此8-羟基脱氧鸟苷成为DNA 氧化损伤的特异性产物[28]。黄颡鱼（Pelteobagrus fulνidraco）肉质鲜美深受人们喜爱，是我国的特种经济养殖鱼类之一，开展水环境污染物对黄颡鱼生理生化及遗传毒性的研究具有现实意义。本研究将黄颡鱼稚鱼暴露于不同质量浓度的SDBS 中，应用微核实验技术和单细胞凝胶电泳技术测定不同暴露浓度条件下的黄颡鱼稚鱼的红细胞微核率和细胞尾部DNA损伤率，测定稚鱼组织中8-羟基脱氧鸟苷的含量，以期为黄颡鱼的健康养殖提供基础资料，同时也为科学评估水体环境浓度的SDBS遗传毒性效应提供依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

实验用黄颡鱼亲本来自湖北省武汉市水产科学研究所，亲本雌雄比例为1∶1，雌鱼体长（171.3 ±9.0）mm，体质量（101.4 ± 16.5）g；雄鱼体长（242.1 ±11.6）mm，体质量（193.4±19.6）g。亲本300 尾在学院实训基地水泥池中流水加曝气方式培育，设棕榈产卵巢，巢为半球形（直径25 cm，深12 cm）；培育水温为（24.5 ± 0.3）℃，pH 为7.0～7.5，溶氧为6.70～9.50 mg/L；光暗周期为12 h：12 h，每日投喂2 次黄颡鱼专用饲料。

1.2 主要试剂与仪器

SDBS 为分析纯（国药集团河南化学试剂有限公司）。荧光显微镜（Olympus-IX81，日本奥林巴斯），电泳仪（DYCZ-32C，北京六一），高速冷冻离心机（Eppendorf 5424R，德国艾本德），酶标仪（DR200-BC，无锡德朗），8-羟基脱氧鸟苷试剂盒（南京建成生物工程研究所）。

1.3 稚鱼暴露实验

随机挑选孵化120 h 后发育正常、大小相近的黄颡鱼稚鱼进行染毒暴露实验。参考地表水环境质量标准(GB3838-2002)及前期水样中阴离子表面活性剂检测数据，设定SDBS 暴露质量浓度为0、0.2、0.4、0.6、0.8 mg/L，每24 h 更换新配制的暴露溶液，以保证浓度恒定。每个浓度处理设置3组平行，暴露实验容器采用12 孔细胞培养板，每孔放置30尾稚鱼。暴露期间水温保持（24.5±0.3）℃，光暗周期设置为12 h:12 h。暴露96 h 后，进行红细胞微核实验和DNA损伤评价。

1.4 稚鱼红细胞微核率测定

每组随机挑取暴露后的黄颡鱼稚鱼6尾送实验室断尾取外周血常规涂片吉姆萨染色。每组计数5 000 个清晰、完整染色的有核红细胞，计算微核率[17-20]。

1.5 稚鱼全鱼细胞DNA损伤评价

每组经SDBS暴露后的8尾稚鱼先用0.1 mol/L、pH 7.2 的磷酸盐缓冲液冲洗，然后将稚鱼的全鱼制成单细胞悬液；配制好的黄颡鱼稚鱼单细胞悬液再经过彗星实验步骤处理后，在荧光显微镜下观察有无彗星及彗尾的长度、亮度、出尾率等[29]。其中裂解时使用的细胞裂解液：2.5 mol/L NaCl，100 mmol/L乙二胺四乙酸二钠（Na2EDTA），10 mmol/L Tris，质量分数1%肌氨酸钠，pH=10，用前加入1%体积的Triton X-100、10%体积二甲亚砜。解旋时使用的碱性电泳缓冲液：1 mmol/L Na2EDTA，300 mmol/L NaOH，pH=13。电泳电压25 Ⅴ，电流300 mA，低温避光，电泳20～40 min。头（尾）部DNA是指彗星细胞头（尾）部DNA 的荧光强度，头（尾）部DNA 占比是指细胞头（尾）部DNA 的荧光强度占所有细胞DNA 总荧光强度的百分比[29]。DNA 损伤率是细胞尾部DNA 占比在2%以上的所有细胞数之和除以被观察的细胞总数，DNA 损伤分级按尾部DNA 占比判断：0 级，＜5%；1 级，5%～20%；2 级，20%～40%；3 级，40%～95%；4 级，＞95%[30]。采用CASP彗星分析软件对彗星图像统计分析DNA损伤率[29]。

1.6 稚鱼组织中8-羟基脱氧鸟苷质量浓度测定

每组随机取15尾稚鱼放入2 mL离心管，以质量(g)∶体积(mL)=1∶9 加入磷酸缓冲液（pH=7），在冰上进行匀浆，4 ℃、2 500 r·min-1条件下离心10 min，取上清液测定8-羟基脱氧鸟苷（8-OHdG）质量浓度。按照试剂盒说明书进行，在酶标仪450 nm 波长条件下测定光密度值。

1.7 数据分析

用SPSS 26.0进行统计学差异检验，采用单因素方差分析(one-way ANOⅤA)和邓肯检验(Duncan's)来对组间多重差异显著性进行比较，P ＜0.05表示有显著差异。每组实验重复3次，数据以平均值±标准差（±SD）表示，使用GraphPad 6.0.1绘制柱状图。

2 结果与分析

2.1 不同暴露浓度下稚鱼红细胞微核率

表1 显示，SDBS 暴露质量浓度为0～0.8 mg/L时，黄颡鱼稚鱼红细胞微核率变化范围为（0.22% ±0.02%）～（0.59% ±0.03%）。随着SDBS 暴露浓度的升高，对应黄颡鱼稚鱼红细胞微核率显著增加(P ＜0.05)，且不同组间差异显著(P ＜0.05)。

表1 SDBS暴露浓度对黄颡鱼稚鱼红细胞微核率的影响Table 1 Erythrocyte micronuclei rate of juvenile Pelteobagrus fulvidraco exposed to different concentrations of SDBS

2.2 不同暴露浓度对稚鱼细胞DNA损伤的影响

如表2 所示，随着SDBS 暴露浓度的升高，稚鱼细胞头部DNA（正常DNA）荧光强度逐渐降低，且SDBS 质量浓度为0.8 mg/L 时，头部DNA 占比显著低于对照组及其他SDBS浓度组(P ＜0.05)。稚鱼细胞尾部DNA（断裂损伤DNA）占比伴随SDBS暴露浓度的升高依次从1.1%显著升高到5.2%(P ＜0.05),说明暴露浓度的升高显著增加了稚鱼细胞DNA损伤，尾部DNA占比显著增加。随着SDBS暴露浓度的升高，尾长增加，尾距增大。与对照组相比，其他暴露浓度组黄颡鱼稚鱼全鱼细胞头部DNA、尾部DNA、尾部DNA占比、尾长和尾矩差异显著(P ＜0.05)。

表2 SDBS暴露浓度对黄颡鱼稚鱼DNA损伤的影响Table 2 Effect of SDBS exposure concentration on the DNA content of juvenile Pelteobagrus fulvidraco

2.3 暴露浓度对黄颡鱼稚鱼细胞尾部DNA 含量的影响

SDBS 暴露浓度与黄颡鱼稚鱼细胞尾部DNA占比的关系如图1 所示，在SDBS 质量浓度为0～0.8 mg/L 时，暴露浓度与稚鱼细胞尾部DNA 占比呈现良好的剂量效应关系，对应的回归方程为=4.6x+1.48（R2=0.939 6，n=24,P ＜0.05）。

图1 暴露浓度对黄颡鱼稚鱼细胞尾部DNA占比的影响Fig.1 Effect of SDBS exposure concentration on tail DNA percentage in the cell of juvenile Pelteobagrus fulνidraco

2.4 不同暴露浓度下黄颡鱼稚鱼DNA 损伤率及损伤等级

表3所示，从DNA 损伤率来看，SDBS暴露对黄颡鱼稚鱼细胞均具有不同程度的遗传损伤，在9.4%～24.7%之间。

表3 不同暴露浓度下稚鱼DNA损伤率及损伤等级Table 3 DNA damage rate and damage grade of juvenile Pelteobagrus fulvidraco under different exposure concentrations

从损伤等级结果来看，0.2～0.6 mg/L 暴露质量浓度的SDBS 对黄颡鱼稚鱼细胞的损伤程度均为1级，0.8 mg/L 暴露质量浓度的SDBS对稚鱼具有1级损伤和一定比例的2 级损伤，但1、2 级的损伤DNA都具有可恢复性，表明SDBS 暴露对黄颡鱼稚鱼的遗传毒性为低毒性。

2.5 不同暴露浓度下黄颡鱼稚鱼组织中8-羟基脱氧鸟苷含量

如图2所示，SDBS暴露质量浓度为0～0.8 mg/L时，黄颡鱼稚鱼组织中8-羟基脱氧鸟质量浓度为（1.7 ± 0.36）～（8.0 ± 0.58）μg/L。随着SDBS 暴露浓度的升高，对应黄颡鱼稚鱼组织中8-羟基脱氧鸟苷质量浓度显著增加(P ＜0.05)。

图2 SDBS暴露浓度对黄颡鱼稚鱼组织8-羟基脱氧鸟苷含量的影响Fig.2 Effect of SDBS exposure concentration on the mass concentrationt of 8-hydroxydeoxyguanosine in juvenile Pelteobagrus fulνidraco tissues

3 讨论

SDBS 可随日常生活污水和工农业生产废水等大量排入水体环境，因水体降解能力有限，SDBS 很容易在水面形成大量积聚不散的泡沫层，泡沫层会影响水体的氧气交换，使水质恶化，而且会影响细胞膜的通透性，产生生物毒性[4-6]。刘淑英等[31]研究表明，暴露在质量浓度为25 mg/L 直链烷基苯磺酸钠等洗涤剂中，鲫（Carassius auratus）鳃组织结构发生变化，膜通透性增大。同时，SDBS 能通过抑制机体的抗氧化作用从而造成细胞遗传物质的损伤，影响DNA 转录与表达等[32]。产生遗传毒性的原因可能是SDBS可显著改变表(界)面的物理化学性质，与细胞膜表面疏水部分结合，破坏了细胞膜结构[33-35]。陈清香等[8]研究表明，SDBS对不同发育期稚鱼毒性效应不同，对鱼卵和仔稚鱼或更小规格稚鱼影响更大。杨代勤等[36]研究表明，小规格稚鱼呼吸系统不完善，依靠皮肤等器官呼吸，接触洗涤剂多；而大规格稚鱼可游至水面吞噬空气，因此吸入洗涤剂较少，导致其抗毒性增强。

鱼类长期生活在水中，尤其是稚鱼对水环境污染物更为敏感，可通过检测鱼类红细胞微核率指示水环境污染状况[17-20]。水体表面活性剂暴露对鱼类的红细胞微核率影响的研究报道仅见于黄鳝(Monopterus albus)和麦穗鱼(Pseudorasbora parνa)中。唐琳等[37]发现，洗衣粉对黄鳝红细胞的损伤主要表现为微核率的增高，且在一定范围内，随着洗衣粉浓度的增加和染毒时间的延长，微核率升高，洗衣粉75 mg/L 处理组的微核率达到显著差异水平。张海艳等[38]研究十二烷基硫酸钠在0～7.5 mg/L的浓度范围对麦穗鱼(P.parνa)仔鱼微核的产生具有明显的影响，且随着浓度的升高而增加，微核率升高速率在4.3～5.6 mg/L 范围内变慢，可能是高浓度的十二烷基硫酸钠除对细胞染色体有一定的损伤外，还对细胞分裂产生干扰，使微核的产生变得缓慢。本研究发现SDBS 暴露质量浓度为0～0.8 mg/L 时，黄颡鱼稚鱼红细胞微核率变化范围为（0.22±0.02）%～（0.59±0.03）%。随着SDBS 暴露浓度的升高，对应黄颡鱼稚鱼红细胞微核率也在显著增加。以上结果说明SDBS等洗涤剂暴露能够诱发鱼类红细胞染色体异常。

单细胞凝胶电泳技术可以灵敏地检测水产动物细胞遗传物质DNA损伤，在水环境污染监测以及有机污染物对水产动物机体的遗传损害等方面有广泛的应用[21-26]。本研究发现，SDBS 暴露对黄颡鱼稚鱼血细胞的DNA 损伤呈现剂量-效应关系。王晓艳等[39]也发现石油烃浓度在0.08 mg/L 在短时间内即可对栉孔扇贝（Azumapecten farreri）血细胞DNA 造成损伤，扇贝DNA 损伤程度与石油烃浓度呈明显的量效关系。周海龙等[40]的研究也表明，多氯联苯、苯并[a]芘、滴滴涕等典型的持久性污染物对紫贻贝（Mytilus edulis）不同组织中DNA 损伤作用均存在较为明显的浓度-效应关系。这说明暴露在不同浓度污染物下的水生生物组织中的DNA 损伤效应随着水污染暴露浓度的增加以及暴露时间的延长，表现出一定的量效关系。

DNA 氧化性损伤是最常见的遗传物质损伤之一，而8-羟基脱氧鸟苷是反应DNA氧化损伤的生物标志物，定量检测8-羟基脱氧鸟苷水平能够反映DNA 氧化损伤的程度，对疾病的早期诊断和治疗至关重要[41]。当前通过检测鱼类8-羟基脱氧鸟苷水平来反应DNA氧化损伤的程度仅见少量报道，大多数研究对象是面向职业暴露镍、铬、汞等方面的工人[42-45]或者小鼠等。刘思思等[46]研究镉暴露导致锦鲤（Cyprinus carpio）肾脏8-羟基脱氧鸟苷水平明显升高。王晓乐[47]研究发现啶磺草胺会引起斑马鱼（Danio rerio）胚胎和幼鱼体内8-羟基脱氧鸟苷质量分数显著升高，进而对斑马鱼造成DNA 损伤，且存在剂量-效应关系。本实验发现随着SDBS 暴露浓度的升高，对应黄颡鱼稚鱼组织中8-羟基脱氧鸟苷质量分数也在显著增加，且不同组间差异显著。结果提示0.2～0.8 mg/L 的SDBS 暴露造成了黄颡鱼稚鱼组织中DNA 氧化性损伤的生物标志物8-羟基脱氧鸟苷水平的显著增加。SDBS 能通过抑制机体的抗氧化作用从而造成细胞遗传物质的损伤，影响DNA 转录与表达等[32]。丁诗华等[27]研究结果表明，采用阴离子表面活性剂直链烷基苯磺酸钠进行草鱼(Ctenopharyngodon idella)毒性试验时，可使草鱼机体产生活性氧，体内的抗氧化酶活性发生改变，从而造成氧化损伤。

本研究探讨了不同暴露浓度的黄颡鱼稚鱼的红细胞微核率和DNA 损伤率，分析了SDBS 对水产动物的遗传毒性影响的机制，但对黄颡鱼遗传毒性潜在的分子及代谢机制仍需进一步研究。