响应面法优化超声波辅助超高压改善牛肉质构的研究

杨宁宁，邓源喜，武 杰，马 龙

（蚌埠学院 食品与生物学院，安徽蚌埠 233030）

超高压技术（Ultra-high pressure） 是在密闭的高压容器中，用液态水作为介质，通过加压产生高压（100～1 000 MPa），使食品物料的蛋白质发生变性、淀粉糊化，能够对食品的质构进行调整的一种新型食品加工技术[1-3]。作为一种绿色安全的食品加工技术，超高压技术在肉制品加工领域的应用较为广泛[4-6]。鲜肉经超高压处理后能够改善肉品嫩度[7-8]、延长货架期，过高的静压力也会导致肉品pH 值的改变及脂肪氧化加剧[9]等理化性质的变化。超声波（Ultrasonic） 是一种绿色的能源，是通过波的形式穿透物体，其空化效应和机械效应可引起肉中组织蛋白酶和Ca2+的释放，破坏肌原纤维和结缔组织，从而起到嫩化作用[10-13]。

随着食品工业的发展及对牛肉制品需求的提高，消费者对原料牛肉的品质要求也进一步提升[14]。嫩度是决定牛肉食用品质的最重要指标之一，影响肉嫩度的重要因素是肌原纤维的结构和结缔组织中胶原蛋白的含量、结构、溶解性和分子之间的交联程度等。关于超声波和超高压技术单独对肉的嫩化处理已有较多研究报道[15-18]，主要探讨超高压技术与超声波的协同作用对牛肉质构的影响，为牛肉质构的改善提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

牛半腱肌肉，购自蚌埠大润发超市，其生理成熟度和背膘厚度等指标基本相似，真空包装-18 ℃下冻存，试验前进行解冻。

试 剂：CaC12、NaCl、KCl、NaHCO3、碘 乙 酸，均为分析纯；L(-)- 羟脯氨酸，法国Sigma-Aldrich（FlukaAnalytica1） 公司提供。

1.2 仪器与设备

UHPF-750MPa 型超高压食品处理装置，包头科发新型高技术食品机械有限公司产品；HN-15AL 型超声波设备，上海汗诺仪器有限公司产品；TA-XT Plus 型质构仪，英国Stable Micro Systems 公司产品；HH 型恒温水浴锅，江苏中大仪器厂产品；FA214 型电子天平，上海海康电子仪器厂产品；C-LM3B 型数显式肌肉嫩度仪，东北农业大学工程学院产品；FJ-200 型高速分散均质机，上海标本仪器厂产品；TGL-20M 型台式高速冷冻离心机，上海卢湘仪离心机仪器有限公司产品。

1.3 试验方法

1.3.1 超高压处理

将牛半腱肌肉从冰箱中取出至室温解冻，清洗修整，然后把肉块切成6 cm×4 cm×2 cm，形状相同、厚薄均匀的肉条，分组真空包装。在室温条件下（25 ℃），用水作为超高压处理的介质，将其他组牛肉样品分别放入超高压仪器中，设置不同的压力进行保压15 min。未进行超高压处理的试验组作为空白对照。取出牛肉样品，擦干表面水分，真空包装后放入5 ℃冰箱中待测定。

1.3.2 超声波处理

将牛半腱肌肉从冰箱中取出至室温解冻，洗去血污，然后把肉块切成大小6 cm×4 cm×2 cm，形状相同、厚薄均匀的肉条，分组真空包装。未进行超声波处理的试验组作为空白对照，其他组分别放入超声波设备中进行不同温度和时间的超声处理。处理完毕之后，放入5 ℃冰箱中待测定。

1.3.3 质构测定

采用TA-XT plus 质构仪对样品进行质构测定，探头型号为P/25。测定条件为：测前速度2 mm/s，测试速度2 mm/s，测后速度1 mm/s，压缩样品高度为40%，探头2 次测定间隔时间5 s，触发类型为自动，触发力为7 g[19]。

1.3.4 剪切力测定

采用C-LM3B 数显式肌肉嫩度仪对样品进行剪切力测定，用空心取样器将处理好的牛肉剪成直径为12.7 mm 的标准肌肉条，用肌肉嫩度仪沿肌纤维垂直方向剪切肉柱，记录读数，做3 组平行试验，取平均值即为最终牛肉的剪切力[20]。

1.3.5 胶原蛋白提取及含量测定

称取50 g 牛肉样品，切成约为1 cm 的肉丁，加入浓度为50 mmol/L 的预冷后的CaC12溶液50 mL，用高速分 散均质机以转速3 000 r/min 处理30 s，经尼龙网（100 目） 过滤，滤渣用预冷的50 mmol/L CaC12溶液50 mL，以转速3 000 r/min 处理30 s，再过滤，上述过程再重复2 次。最终得到的滤渣为结缔组织胶原蛋白[21]。

采用Ringer'S试剂溶解法提取可溶性胶原蛋白[22-23]。可溶性胶原蛋白含量[24]=羟脯氨酸含量×7.25.

1.3.6 数据处理

每试验处理组重复测定5 次，使用SPSS 22.0 软件进行数据分析，试验数据用（X±S） 的形式表示；用单因素方差分析各处理组之间的差异显著性。

1.3.7 单因素试验

（1） 不同压力水平对牛肉质构的影响。在室温条件下，将处理好的牛肉样品放入超高压食品处理装置内，分别设置100，200，300，400，500 MPa压力进行保压试验15 min，取出置于5 ℃冰箱内待测定。

（2） 不同超声时间对牛肉质构的影响。确定最佳的超高压压力后，在室温条件下（25 ℃），把样品放入超声波处理装置内，超声功率为160 W，分别经过30，40，50，60，70 min 超声处理，取出置于5 ℃冰箱内待测定。

（3） 不同超声温度对牛肉质构的影响。确定最佳的压力和超声时间后，把样品放入超声波处理装置内，设置超声功率为160 W，分别经过10，20，30，40，50 ℃超声处理，取出置于5 ℃冰箱内待测定。

1.3.8 响应面试验设计

以超高压压力水平（A）、超声时间（B） 和超声温度（C） 为3 个因素，以牛肉剪切力值为响应值（Y） 进行响应面试验设计，探讨改善牛肉嫩度最佳的超高压压力，超声时间和超声温度。

2 结果与分析

2.1 超高压压力对牛肉质构的影响

当保压温度为25 ℃，保压时间15 min 时，随着超高压处理压力的增大，牛肉样品的硬度、弹性和咀嚼性等质构特性呈现先下降后上升的趋势，且在300～400 MPa 时取得最低值。样品经过超高压处理后，由于压力作用使牛肉细胞内质网线粒体等结构遭到破坏，Ca2+被释放出来，钙激活酶被激活，促进了肌肉蛋白水解，加速了牛肉成熟，导致牛肉硬度降低，嫩度得到有效改善。当处理压力为200～400 MPa时，高静压力使牛肉肌原纤维断裂，肌肉的结构完整性受到破坏，硬度有所下降，相应的弹性和咀嚼性也降低；当压力大于400 MPa 时，过高的静压力导致牛肉结缔组织胶原蛋白发生变性，其机械强度有所增加，牛肉的硬度、弹性和咀嚼性都有所上升。这说明200～400 MPa 的压力可以有效改善牛肉的质构特性，而且在处理压力300 MPa 时效果最好。

不同超高压压力水平对牛肉质构的影响见表1。

表1 不同超高压压力水平对牛肉质构的影响

2.2 超声时间对牛肉质构的影响

不同超声时间对牛肉质构的影响见表2。

表2 不同超声时间对牛肉质构的影响

当超声时间为30～40 min 时，牛肉的硬度下降较为明显，这在一定程度上说明了超声处理具有肌肉嫩化的作用。对于弹性而言，当超声时间30～40 min时，与对照组相比牛肉弹性显著降低，因为超声处理会改变肌肉纤维收缩、肌纤维骨架蛋白和结缔组织的含量[25]，在一定时间内对牛肉进行超声波处理可以有效降低肌肉剪切力，从而使弹性降低。由上述分析可知，牛肉在40 min 的超声处理后可以更好地改善其质构特性。

2.3 超声温度对牛肉质构的影响

不同超声温度对牛肉质构的影响见表3。

表3 不同超声温度对牛肉质构的影响

由表3 可知，随着超声温度逐渐升高，牛肉硬度和咀嚼性呈现先缓慢下降后快速下降的趋势。因为超声温度过高，会引起蛋白质和脂肪分解，蛋白质发生部分变性，牛肉汁液流失加剧，导致牛肉硬度和咀嚼性变化较大。牛肉样品经过超声处理后，牛肉的弹性呈现先升高后下降的趋势，当超声温度处于20 ℃时，牛肉弹性达到最高值。总体来看，当超声温度处于20～30 ℃时，牛肉的硬度会有所下降，牛肉的弹性增加，能够有效地改善牛肉的质构特性。

2.4 超声波辅助超高压处理过程中牛肉肌内结缔组织胶原蛋白含量的变化

当超声时间15 min，超声功率为160 W，超声温度20 ℃，超声时间40 min 时，探讨不同超高压压力对牛肉肌内结缔组织胶原蛋白含量的变化。

不同超高压压力对牛肉结缔组织胶原蛋白含量的影响见表4。

表4 不同超高压压力对牛肉结缔组织胶原蛋白含量的影响

由表4 可知，超高压压力对牛肉结缔组织中总胶原蛋白和可溶性胶原蛋白的含量具有一定的影响，随着压力的升高，两者的含量也逐渐增加。牛肉经高压及超声波空化协同作用后，肌原纤维部分断裂，提高了部分胶原蛋白的溶解性[26]。研究表明胶原蛋白结构的变化能够影响肉的嫩度[27]，随着可溶性胶原蛋白含量的增加，牛肉的质构特性也会发生改变，硬度和弹性不断下降，牛肉的嫩度得到有效改善。

2.5 响应面试验结果

2.5.1 Box- behnken 响应面试验设计

采用Box-behnken Design（BBD） 进行试验设计，以超高压压力、超声时间、超声温度为自变量，分别用A，B，C 表示，以编码值-1，0，1 代表因素A，B，C 的相应水平。利用Design Expert 软件进行响应面试验安排，以牛肉的剪切力值为响应值。

响应面试验因素水平编码表见表5，响应面试验及结果见表6。

表5 响应面试验因素水平编码表

表6 响应面试验及结果

2.5.2 主效应分析

回归模型方差分析见表7。

表7 回归模型方差分析

对上述试验结果进行响应面分析，得到牛肉剪切力和编码自变量的二次回归模型方程：

由表7 可知，模型的F=30.34，p＜0.000 1，证明试验所选用的二次模型具有极显著性。失拟项F=3.18，p=0.146 7＞0.05，失拟不显著，结果表明该回归方程与实测值的拟合度较好。模型中一次项超声波处理温度（C） 则显著的（p＜0.05），超高压压力（A） 和超声时间（B） 的影响均是不显著的（p＞0.05）。在交互项中，因素A×C 是极显著的（p＜0.01）。在所选的各因素水平范围内，按照对结果的影响排序为C＞A＞B，即超声温度＞超高压压力＞超声时间。回归模型参数见表8。

表8 回归模型参数

表8 中模型的决定系数R2（校正后） 为94.29%，说明该模型可以解释94.29%响应值的变化，方程拟合较好，并且变异系数为3.00%，表明试验的精确度高、可靠性强。所以，该回归方程可用来对牛肉质构中的嫩度进行优化。

2.5.3 响应面分析

各因素交互作用对牛肉剪切力影响的响应面和等高线图见图1。

图1 各因素交互作用对牛肉剪切力影响的响应面和等高线图

在图1（b） 中，超高压压力（A） 和超声温度（C） 交互作用的响应曲面较为陡峭，等高线图呈椭圆状，表明这2 组因素间的交互作用较强，这与上述模型方差分析因素A×C 是极显著的（p＜0.01） 是相符合的；超高压压力（A） 和超声时间（B）、超声时间（B） 和超声温度（C） 响应曲面较为平缓，等高线图中心圆趋近圆形，说明因素间交互作用相对较弱。

通过回归模型的预测，得到牛肉质构剪切力最小的条件为超高压压力302.52 MPa，超声时间41.37 min，超声温度23.31 ℃，模型预测剪切力值为36.32 N。利用响应面优化得到的最佳条件进行多次验证试验，实际测得的平均剪切力值为36.89，与模型预测值进行对比，相对误差仅为1.57%，说明响应面试验的精确度高，可靠性强。一般市售新鲜牛肉的剪切力值为50～60 N，试验通过响应面法优化超声波辅助超高压处理的牛肉其质构得到改善，剪切力值下降了30%～40%，嫩度得到了有效提升，具有一定的实用价值。

3 结论

超高压技术与超声波协同处理可以改善牛肉的质构特性，起到一定的嫩化作用。超声波辅助超高压处理后的牛肉结缔组织总胶原蛋白和可溶性胶原蛋白的含量随着处理压力的升高而增加。随着可溶性胶原蛋白含量的增加，牛肉的质构特性也会发生改变，硬度和弹性不断下降，牛肉的嫩度得到有效改善。通过响应面法对回归模型进行预测，结果表明，对于牛肉的嫩度值各因素影响程度大小顺序为超声温度＞超高压压力＞超声时间。通过优化验证，牛肉质构剪切力最小的条件为超高压压力302.52 MPa，超声时间41.37 min，超声温度23.31 ℃，模型预测剪切力值为36.32 N。与一般市售新鲜牛肉相比，其剪切力值下降了30%～40%，具有一定的生产应用价值。