黑色素瘤细胞外泌体通过Prospero同源异形盒蛋白1调控肿瘤淋巴转移机制的研究

曹宸，杨莹，孙秋悦，严志新，杨细虎

黑色素瘤（melanoma，MM）是常见的软组织恶性肿瘤，近年来发病率不断上升［1-2］。皮肤黑色素瘤恶性程度高，早期易发生扩散和转移。当前治疗手段仍然有限，临床上常采用手术切除、放疗、化疗和一些姑息性治疗等常规治疗方式，但存在预后差等问题。随着皮肤黑色素瘤的免疫治疗、靶向治疗［3］等方法取得显著进展，病人的预后有了一定的改善，但肿瘤过早发生淋巴转移及生存率低等问题依旧没有得到有效的解决。此外，由于皮肤黑色素瘤的异质性和分子水平上的个体差异，仍有部分病人存在抗肿瘤药物无效、肿瘤细胞耐药以及肿瘤靶向治疗费用偏高等问题［4］，因此继续探索其他有效的治疗方案在临床上具有重要意义。

近年来，多种研究表明淋巴管再生在肿瘤的增殖和进展中起着非常重要的作用［5-6］。随着淋巴管内皮细胞特异性标志物平足蛋白（podoplanin）、淋巴管内皮细胞透明质酸受体-1（lymphatic vessel endo‑thelial hyaluronic acid receptor-1，LYVE-1）及血管内皮生长因子受体3（VEGFR-3）等蛋白的发现，淋巴管再生在肿瘤进展和转移中的重要作用日益明朗［7-10］。研究表明淋巴管转移是皮肤黑色素瘤的主要转移方式［11-12］，黑色素瘤癌巢及间质中的淋巴管新生是肿瘤转移的前提。因此，通过抑制瘤体内及肿瘤周围的淋巴管新生，减少瘤体内和肿瘤周围的淋巴管数量，理论上可以推迟、延缓肿瘤经淋巴管转移，从而延长病人的生存时间。现有证据表明，黑色素瘤细胞与其所在微环境中的其他细胞及细胞间产物相互作用，导致了淋巴管的新生及肿瘤转移［13］，其中涉及到复杂的细胞间信号传递。然而，黑色素瘤如何调控淋巴管新生及其如何通过淋巴管转移的机制仍不清楚［14-15］。

在肿瘤的进展和转移中，诱导肿瘤旁间质生成新的淋巴管是极为重要的一步。最新的文献报道，一种被称作为外泌体的细胞外囊泡可通过介导细胞间信号传递来影响肿瘤的转移。这些外泌体内包含的信号因子可调节受体细胞的增殖、分化、免疫功能等生理活动。这些外泌体被肿瘤细胞释放在细胞质中，通过细胞的胞吞、胞吐和受体介导及弥散等一系列的方式作用于靶细胞发挥其重要功能。

Prox-1 是淋巴管生成的关键性调控因子［16］。该信号不仅参与淋巴管的再生及塑形过程，也参与调控肿瘤淋巴转移的过程［17］。已有文献报道Prox-1及其下游信号叉头框C2 蛋白（FoxC2）、磷酸化蛋白激酶B（p-Akt）等参与消化道肿瘤、子宫内膜癌及宫颈癌的淋巴转移［18-20］，但在黑色素瘤淋巴转移中未见相关报道。因此，本研究提出黑色素瘤外泌体携带的Prox-1 在调控淋巴管内皮细胞增殖、迁移以及生成具有转移肿瘤细胞功能的病理性淋巴管过程中具有重要作用。

1 资料与方法

1.1 细胞实验材料DMEM 培养基、胎牛血清、胰蛋白酶（Gibco，美国）；A375 人源黑色素瘤细胞系（中国科学院上海细胞所，中国）；LECs 淋巴管内皮细胞（中国科学院上海细胞所，中国）；磷酸盐缓冲液（Biofroxx，德国）；BCA 蛋白定量试剂盒、辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG 和HRP 标记山羊抗小鼠IgG（H+L）（碧云天生物有限公司，中国）；RQT100 羊抗鼠/兔IgG 聚合物（即用型）、GADPH 抗体、Prox-1 抗体、p-Akt 抗体、FoxC2 抗体（Abcam，美国）；外泌体试剂盒（南京森贝伽生物科技有限公司，中国）；二氧化碳细胞培养箱（Sanyo，日本）；多功能酶标仪（BioTek，美国）；化学发光成像仪（Tan‑non，中国）。

1.2 一般资料样本选自2015 年9 月至2021 年4月在江苏大学附属医院收治的32 例原发性黑色素瘤病人。筛选条件：①病人行黑色素瘤切除手术；②肿瘤原发灶蜡块保存完整；③病历资料及临床病理材料完整。共选取32 例病人，其中：男性18 例，女性14 例。年龄范围40～90 岁。32 例病人病理学显示：癌症早期病人（Ⅰ期和Ⅱ期）8 例，癌症晚期病人（Ⅲ期和Ⅳ期）24 例；有淋巴结转移者16 例，未发生淋巴结转移者16 例。选取2 例正常皮肤组织的临床病理资料作为对照。本研究获得江苏大学附属医院伦理委员会批准（批号KY2022K120 5），病人及近亲属对研究方案了解并签署知情同意书。

1.3 免疫组化试剂兔抗人Prox-1 单抗（即用型）、兔抗人LYVE-1 单抗（即用型）、RQT100 羊抗鼠/兔IgG聚合物（即用型）、DAB显色液。

1.4 方法

1.4.1 细胞培养人淋巴管内皮细胞（LECs），于内皮细胞培养基（EGM-2；Cambrex）中培养。A375 黑色素瘤细胞购自中国科学院上海细胞所，于DMEM中培养。所有细胞均保持在37 ℃，5%二氧化碳条件下。DMEM 中添加10%FBS。所有的给药实验均为细胞稳定传代3代以上。

1.4.2 Prox-1 的慢病毒敲除根据吉凯基因慢病毒使用说明手册，设置梯度MOI 进行预实验。实验结果表明本次感染采用MOI 为50。接种105个细胞于6 孔板中，分别加入以下病毒：shProx-1、GFP 50×105TUI 病毒。按上述方法感染细胞，24 h 后更换为完全培养基。于恒温培养箱中继续培养，显微镜下观察细胞密度至80%~90%时，提取蛋白或传代至培养瓶中。采用免疫荧光法检验转染效率。制备Prox-1修饰的MM-ex和MM-exshProx-1，将转染慢病毒的MM 在无血清培养基中培养72 h，分离出MM-ex/MM-exshProx-1用于进一步研究。

1.4.3 外泌体鉴定

1.4.3.1透射电子显微镜法 通过透射电子显微镜（FEI Tecnai 12，飞利浦，荷兰）分析MM-ex 的形态和大小。将10 µL 的黑色素瘤在涂有甲醛/碳的铜网格上，吸附10 min，用10 µL 的1%磷酸在25 ℃下染色5 min，并用透射电子显微镜检查。透射电镜得到了扬州大学检测中心的技术支持。

1.4.3.2原子力显微镜成像 对MM-ex进行原子力显微镜（AFM）成像。将0.25 g MSC-ex 溶解于10µL PBS 中，沉积在云母片上。在室温干燥后，采用多模式第八代SPM（德国布鲁克）扫描样品，并使用纳米显微镜进行分析。

1.4.3.3纳米光追踪分析 通过纳米光追踪分析（NTA）测量MM-ex的数量和大小分布。将MM-ex在PBS中稀释，并注射到LM10装置的样品室中。每个样本记录30 s或60 s，使用纳米NTA 3.1软件对视频进行分析。根据总量和稀释因子计算相对浓度。

1.4.4 细胞迁移、增殖

1.4.4.1细胞增殖 采用CCK-8 试验评估淋巴管内皮细胞增殖。96 孔板中以每孔103个细胞的密度接种细胞，于恒温培养箱中培养过夜。吸弃培养基后，采取PBS（n=5）、MM-ex（50 或100 µg/孔，n=5）处理LECs 48 h。采用PBS 制备阴性对照。类似地，将MM-exshProx-1（每孔50 µg，n=5）处理36 h。加入WST-8，测定细胞增殖（450 nm）。

1.4.4.2细胞迁移 采用Transwell 实验观察MM-ex转运的Prox-1 对LECs 迁移的影响。实验分三组：PBS 组、MM-ex 组、MM-exshProx-1组（外泌体溶解在PBS中）。选取外泌体的使用剂量为50 mg/L。细胞接种培养方法同细胞增殖实验。六孔或十二孔细胞培养板配套的8 µm 孔径细胞培养池纤维连接蛋白铺底（40 mg/L）干燥，置入六孔细胞培养板，接种细胞，并按分组加入不同的等容积的刺激因子，置于37 ℃，5%二氧化碳条件下培养16 h 后取出细胞培养池行Giemsa 染色：PBS 浸洗细胞培养池1 min×3次，甲醇固定20 min，自然干燥，用Giemsa 染液染色10 min，蒸馏水浸洗。在倒置相差显微镜下每个细胞培养池随机选取5个高倍视野，计数膜上、下的细胞，以及迁移到膜下的细胞数除以膜上下细胞总数计算细胞的迁移率。

1.5 蛋白质印迹法检测黑色素相关蛋白表达选取生长对数期的细胞进行处理。裂解细胞并提取细胞总蛋白质，总蛋白质（40 µg）在SDS-PAGE 凝胶上分离，使用电泳转移系统（Bio-Rad，USA）转移到硝酸纤维素滤膜上。将膜在常温下用含有5%脱脂奶粉的TBST 封闭1.5 h。4 ℃下与抗体一起孵育过夜。二抗在常温下孵育1 h。通过增强化学发光显现，检查特征蛋白表达及其下游信号通路激活情况。

1.6 免疫荧光染色实验分三组：PBS 组、MM-ex组、MM-exshProx-1组（外泌体溶解在PBS 中）。每组各24 个培养孔。外泌体使用剂量为50 mg/L。细胞传代时，换用1%BSA 的EGM-2-MV 培养基及上述分组不同的等容积的刺激因子，LECs 培养2～3 代后细胞爬片，用PBS冲洗后，用4%多聚甲醛固定10 min，PBS 漂洗3 次，分别滴加兔抗小鼠一抗Prox-1、CD9、VEGFR-3、抗体滴度为1∶500。置湿盒内4 ℃冰箱孵育过夜。PBS漂洗3次，滴加羊抗兔FITC 或PE 荧光二抗，置湿盒内37 ℃孵育30 min，PBS 漂洗3 次，蒸馏水漂洗2 次，荧光显微镜下检测染色结果，用Hoechst进行细胞核衬染照相。

吸弃细胞培养基，PBS 洗涤两次，4%PFA 室温固定。PBS洗涤一次，0.1%Triton通透工作液室温通透10 min。吸弃Triton 通透工作液，5%BSA 室温封闭60 min。加一抗，2～8 ℃孵育过夜。PBS洗涤后，DAPI封片染核，室温避光孵育5 min，使用荧光共聚显微镜观察

1.7 免疫组化染色所取全部标本中Prox-1、LYVE-1的水平选用免疫组化法进行检测。具体步骤如下：选用4%中性甲醛溶液（NBF）固定（25 ℃，24 h），以乙二胺四乙酸二钠（EDTA），0.1 mol，（pH 8.0）为抗原修复液对抗原组织进行修复。修复时间为喷气计时2 min 30 s，使用3%双氧水灭活。Prox-1、LYVE-1一抗均采用PBS依据说明书进行稀释，于4 ℃条件下孵育过夜。二抗选择RQT100羊抗鼠/兔IgG聚合物（即用型），于25 ℃条件下孵育20 min，选用DAB显色液，显色5 min。苏木精复染30 s，脱水，中性树脂封片。用共聚焦激光扫描显微镜检测载玻片。

1.8 免疫组化结果判定使用MLVD 计数法表示LYVE-1，计数方式为［21］：在显微镜下对淋巴管进行观察，单个淋巴管为单个内皮细胞或细胞簇，呈棕黄色。在低倍镜（40 倍镜）视野下选择淋巴管高密度区，然后在高倍镜（200倍镜）视野下随机选择5个视野内淋巴管进行计数，计数结果计算平均值。Prox-1主要为胞核染色。使用低倍镜（40倍镜）观察全片，确定肿瘤浸润的组织边缘，然后选择5个高倍镜（400 倍镜）视野下的细胞对其染色强度及所占百分比进行综合评分。染色强度判分标准：细胞未着色为0 分（-）、浅黄色为1 分（+）、棕黄色为2 分（++）、棕褐色为3 分（+++）。阳性细胞所占百分比判分标准［22］：阳性细胞<1%为0 分；1%～10%为1分、10%～30%为2 分；30%～60%为3 分；>60%为4分。以细胞染色强度与阳性细胞所占百分比评分之和作为染色结果的判定，阴性或低表达：0～3 分；高表达：≥4 分。0～3 分为低表达组，≥4 分为高表达组。见图1。

图1 Prospero同源异形盒蛋白1（Prox-1）、淋巴管内皮细胞透明质酸受体-1（LYVE-1）在黑色瘤切除标本的皮肤组织中的表达：1A为正常皮肤组织组织中Prox-1阴性表达（IHC染色×100）；1B为LYVE-1在黑色素瘤淋巴管中阳性表达，用微淋巴管密度表示（IHC染色×400）;1C为Prox-1阴性染色（−）（IHC染色×400）；1D为Prox-1弱阳性染色（+）（IHC染色×400）；1E为Prox-1中阳性染色（++）（IHC染色×400）；1F为Prox-1强阳性染色（+++）（IHC染色×400） 图2 逆转录病毒感染黑色素瘤细胞图（免疫荧光显色法×4） 图5 黑色素瘤外泌体粒径表征 图6 黑色素瘤细胞体外培养对淋巴管内皮细胞淋巴管生成有剂量依赖性影响：6A为免疫荧光法观察外泌体与LECs细胞共培养36 h的影响（免疫荧光染色法×100）；6B为验证MM-ex/MM-exshProx-1对LECs迁移的影响（Transwell法×10）；6C为LECs在MM-ex/MM-exshProx-1的作用下，淋巴管标志物VEGFR-3的荧光表达（免疫荧光染色法×20） 图9 人来源的CD9阳性MM-ex/MM-exshProx-1定位于LECs的细胞质中（免疫荧光染色法×20）

1.9 统计学方法本研究的数据采用SPSS 进行检验，P<0.05 表明数据间的差异有统计学意义。应用费希尔精确检验方法检验Prox-1 的表达高低与病人临床病理特征的关系。应用MLVD 表示LYVE-1的表达水平，探究MLVD 值与病人临床病理特征的关系，两组样本间比较符合正态分布且方差齐者采用两独立样本t检验，若不符则采用秩和检验。三组样本间比较先进行方差齐性检验，方差齐且符合正态分布采用单因素方差分析，反之则采用Krus‑kal-WallisH检验。Prox-1 和LYVE-1 的表达的相关性采用Pearson 相关分析。检验标准α=0.05。

2 结果

2.1 黑色素瘤外泌体敲减Prox-1 基因如图1 所示，我们用逆转录病毒感染黑色素瘤细胞（图2）敲减Prox-1 基因，得到不含有Prox-1 基因的黑色素瘤外泌体（图3）。采用试剂盒法提取两种外泌体：MM-ex、MM-exshProx-1。

图3 黑色素瘤外泌体慢病毒敲减后提取出不含Prox-1信号的外泌体

2.2 黑色素瘤外泌体表征对黑色素瘤外泌体进行表征如图4 所示，蛋白质印迹法结果证实了外泌体标记CD9、CD63和肿瘤易感基因101（TSG 101）在MM-ex 中的表达。与黑色素瘤相比，上述蛋白在黑色素瘤外泌体中的表达明显增高（图4A）。透射电子显微镜（TEM）和原子力显微镜（AFM）显示MM-ex的球体形状（图4B）。采用纳米粒子跟踪分析（NTA），表明所得MM-ex 的平均粒径约为130 nm（图5）。

图4 黑色素瘤外泌体表征：A为外泌体标记CD9、CD63和TSG101在MM、MM-ex中的表达；B为外泌体电镜表征

2.3 黑色素瘤外泌体对淋巴管内皮细胞淋巴管生成的影响为了探究MM-ex 是否对淋巴管生成产生直接影响，将LECs 与所得外泌体共同孵育36 h。共聚焦成像结果显示，标记的MM-ex 在孵育12 h 后主要位于细胞质和细胞核周围，且数量随着时间的推移而增加（图6）。为探讨MM-ex 对淋巴管内皮细胞淋巴管生成的影响，将LECs 与不同剂量的MMex、MM-exshProx-1共同孵育24 h。结果表明，MM-ex 以剂量依赖性方式促进淋巴管内皮细胞增殖（图7）、迁移（图6）。MM-exshProx-1对淋巴管内皮细胞的增殖及迁移无明显影响。LECs在MM-ex的作用下，标志物VEGFR-3 表达明显升高，提示LECs 增生活跃（图6），MM-exshProx-1作用的LECs 却没有。这些结果表明，含Prox-1 的MM-ex 可以剂量依赖性促进淋巴管内皮细胞生成淋巴管。

图7 CCK8法验证MM-ex/MM-exshProx-1对淋巴管内皮细胞淋巴管增殖影响：A为加入50 µg和100 µg的MM-exshprox-1与加入pbs组 对lec增殖情况的影响；B为加入50 µg的MM-ex与pbs组对lec增殖情况的影响；C为加入100 µg的MM-ex与pbs组对lec增殖情况的影响

2.4 黑色素瘤外泌体参与调控淋巴管生成的机制为从机制上探讨MM-ex 促进淋巴管内皮细胞的增殖和迁移，在MM-ex 和MM-exshProx-1作用于LECs的第12、24、36 h 评估淋巴管生成基因的表达（图8）。研究发现，经MM-ex 预处理LECs 后，FoxC2、Prox-1、p-Akt 的表达随着时间的推移而显著增加至12 h 后逐渐衰减。经MM-exshProx-1预处理LEC 后，FoxC2、Prox-1、p-Akt 随着时间的表达变化量不明显。免疫荧光染色证实人来源的CD9 阳性MM-ex、MM-exshProx-1可以定位于LECs 的细胞质中（图9）。

图8 作用于LECs的第12、24、36 h评估淋巴管生成基因的表达：A为黑色素瘤外泌体（MM-ex）；B为低表达Prox-1的黑色素瘤外泌体（MM-exshProx-1）

2.5 Prox-1 表达、MLVD 值与黑色素瘤临床病理特征的关系2 例正常皮肤组织组织中Prox-1 表达为阴性。Prox-1 在黑色素瘤中主要染色部位在胞核。32 例黑色素瘤病理中，Prox-1 高表达率为62.5%，有淋巴结转移组高表达率为87.50%，表达率显著高于无淋巴结转移组37.50%（P<0.05）；癌症晚期组Prox-1 高表达率为79.17%，显著高于癌症早期组12.50%（P<0.05）；长径小于5 cm 的肿瘤Prox-1 高表达率为38.46%，而长径大于5 cm 的Prox-1 高表达率为78.94%（P<0.05）。性别和年龄因素对黑色素瘤组织中Prox-1 表达水平影响无统计学意义（P>0.05）。

黑色素瘤标本中的淋巴管内皮细胞经免疫组化LYVE-1 抗体染色后呈现为棕黄色，32 例黑色素瘤MLVD 均值为7.48±3.91。性别、年龄和肿瘤长径对黑色素瘤组织中MLVD 值差异无统计学意义（P>0.05），黑色素瘤有淋巴结转移组和癌症晚期组的MLVD 值分别高于无淋巴结转移组、癌症早期组，差异有统计学意义（P<0.05）。具体情况见表1。

表1 黑色素瘤组织32例中Prospero同源异形盒蛋白1（Prox-1）表达、微淋巴管密度（MLVD）值与其临床病理特征的关系

2.6 Prox-1 表达水平与MLVD 的相关性32 例黑色素瘤组织中，Prox-1高表达组MLVD 为8.88±4.20，低表达组MLVD 为5.15±1.72（r=0.47，P=0.007）。Pearson 相关分析显示，Prox-1 表达情况与MLVD 值呈相关性，即Prox-1 高表达组的MLVD 值高于Prox-1低表达组的MLVD值。

3 讨论

黑色素瘤是临床常见恶性肿瘤，发病率逐年上升，预后差，且治疗方式有限。特别是在癌症晚期且有肿瘤淋巴结远处转移的病人5 年生存率仍然低至5%~10%［23-25］。因此，肿瘤的早发现和早治疗是提升病人生存率的关键。现阶段，监测肿瘤淋巴结转移仍具有一定的挑战性。本研究旨在肿瘤淋巴管的形成中探索和发现肿瘤淋巴结的转移途径。当前，各类皮肤肿瘤的外泌体已成为学者们研究的方向，为确定外泌体对肿瘤转移机制的影响及预后指标提供新的方向。本研究主要探究MM-ex 在肿瘤瘤体及周围间质的刺激对生成新生淋巴管的影响，结果表明MM-ex 促进淋巴管内皮细胞增殖及迁移，促进VEGFR-3、LYVE-1 阳性淋巴管的生成。

黑色素瘤的进展与淋巴管的诱导成形密切相关。大量文献报道及研究仅关于黑色素瘤血管生成及转移的机制，关于淋巴管转移转移机制尚不明确。现阶段已有研究表明Prox-1、FoxC2［26］、LYVE-1、VEGFR-3［27-29］等淋巴管生成的标志物已在黑色素瘤病人中被确立。迄今为止分析的所有标志物并未将淋巴管生成与黑色素瘤的转移相联系作为一个新的预后判断指标。也有文献报道Prox-1 调控LECs 的增殖及迁移和淋巴管的成熟，Prox-1 及其下游因子FoxC2 促进淋巴管瓣膜及淋巴管壁的形成［30］。Prox-1 已在宫颈癌、胃癌中被证实与肿瘤转移相关。Prox-1在肿瘤细胞中作为淋巴管生成的起始因子，可使其成为监测和治疗的一个强有力的靶点。且MM-ex 由肿瘤细胞自分泌产生，表明此种细胞间递质可在胞质中进行监测。

本研究分析了黑色素瘤细胞分泌的MM-ex 对肿瘤淋巴管生成的影响。为了验证这一假说，我们进行了Prox-1介导功能的缺失实验。这些实验证明Prox-1敲减后的外泌体显著降低了肿瘤周围淋巴管的生成，减少了LECs 的增殖和迁移，从而有效的减缓了肿瘤的转移。

实验结果表明：肿瘤细胞产生的MM-ex 中Prox-1可激活Akt信号途径，促进肿瘤间质中淋巴管内皮细胞形成新生淋巴管，同时促进淋巴管生成因子受体VEGFR-3 的表达上调。因此肿瘤影响了正常组织淋巴管生成受体信号的表达和识别。由此支持了一种新兴学说：肿瘤细胞利用内皮细胞的淋巴管生成信号系统（即迁移、侵袭和增殖调节信号系统）来支持与肿瘤细胞自身进展相关的侵袭和转移机制［31］。

本研究发现黑色素瘤病人癌巢及癌周组织中，Prox-1、LYVE-1 表达水平明显高于正常皮肤组织。同时，Prox-1、LYVE-1 表达水平与病人的肿瘤负荷程度、疾病的分期和病人的生存率相关。与正常皮肤相比，黑色素瘤病人标本中心灶Prox-1 有显著差异，Ⅲ期和Ⅳ期黑色素瘤病人癌巢中心及周围间质，Prox-1、LYVE-1 的表达明显高于Ⅰ期和Ⅱ期黑色素瘤病人。这使得病理切片及免疫组化可更高效地监测肿瘤的进展。

基于以上结果，可推测Prox-1 不仅是肿瘤进展和转移的标志，在功能上也参与了黑色素瘤的转移，由此进一步推测肿瘤分泌含有Prox-1 的外泌体在此间发挥了重要作用。为进一步验证假说，我们对肿瘤样本及人源的黑色素瘤A375 细胞系中分泌的含有Prox-1的外泌体进行了详细研究。实验证实了外泌体被肿瘤细胞释放后被间质中相关的内皮细胞所吸收，在信号传递中发挥了重要作用。因此相关内皮细胞胞质间高表达的Prox-1对监测Ⅲ期及Ⅳ期肿瘤有显著贡献。

因此，本研究认为Prox-1 是黑色素瘤进展的一个新的标志物，也可通过病理切片的染色判断病人的预后。这项关于黑色素瘤外泌体Prox-1的研究具有广阔前景，值得在更多的Ⅰ~Ⅳ期黑色素瘤病人中作出进一步的分析。此外，外泌体作为一种新兴的细胞间传递因子并结合黑色素瘤自分泌外泌体的特性，使通过针对外泌体来治疗人类黑色素瘤成为了一个新的趋势。目前，人们正努力生成Prox-1及外泌体的新抑制剂以治疗和干扰肿瘤淋巴转移。本研究数据有力地提供和证明黑色素瘤分泌的含有Prox-1 的外泌体促进了肿瘤淋巴转移的新途径。并且提供了一个新的转移监测靶点，贡献一个治疗黑色素瘤的新策略。