利用InDel标记划分玉米自交系的杂种优势群

黄艳艳, 许理文, 王凤格, 康定明, 陈全家

(1.新疆农业大学农学院, 乌鲁木齐 830052;2.北京市农林科学院玉米研究中心,玉米DNA指纹及分子育种北京市重点实验室, 北京 100097)

玉米杂种优势类群划分和杂种优势模式构建是玉米自交系选育和杂交组合组配的重要依据,对提高玉米育种效率具有重要意义。杂种优势划分通常用形态标记、细胞学标记、配合力表现[1]以及系谱分析等方法[2],但在人工的干扰下,以及遗传漂移的作用和系谱资料的丢失等原因,这些方法在进行遗传变异分析时有一定的局限性[3]。近年来,分子标记技术发展迅速,为自交系杂交优势群的划分提供了一定的分子学依据,划分结果更加准确。国内外学者利用SNP[4]、SSR[5]、InDel等分子标记分别对亲缘关系明确的玉米材料进行杂种优势群划分,所得结果与系谱资料基本吻合[6-9]。

插入/缺失(Insertion-Deletion,InDel)是指基因组中一个或多个核苷酸的插入或缺失所产生的长度多态性。其具有以下特点: 1) 分布广泛[10-11]; 2) 稳定性强(复发性突变发生的几率较小)[12]; 3) 地理上分离的群体间等位基因频率存在显著差异,有可能作为祖先信息标记[13-14]; 4) 小的InDel可以在短的扩增子中进行分析(InDel序列长度小于10 bp),且能对高度降解的DNA样品进行准确分型。InDel标记作为最近几年新兴的分子标记,被广泛应用于玉米种质遗传多样性研究。林峰等[15]利用135对InDel分布在玉米10条染色体上的分子标记引物,系统分析了491份玉米自交系的遗传多样性,为组配优良玉米杂交种提供了遗传信息。

本研究利用北京市农林科学院玉米研究中心构建的多重扩增靶向捕获测序基因分型InDel标记组合(包含1 618个InDel标记),对102份玉米自交系进行InDel标记的基因分型,旨在对新选、引育的优良自交系进行杂种优势群划分,为种质改良、扩增和创新及杂交组合的亲本选配提供理论依据和技术支持。

1 材料与方法

1.1 材 料

本实验收集的玉米材料属于中国玉米育种中应用的新种质,并且具有较为广泛的代表性和时效性,玉米材料共有102份,其中有X 178、郑58、Mo 17、昌7-2、B 73、丹340等标准测验种(表1)。

表1 供试玉米自交系名称

图1 1 618个(a)和1 011个(b)InDel标记的基因分型

1.2 仪器及耗材

光照培养箱、离心管(2 mL、1.5 mL)、钢珠、剪刀、液氮罐、组织研磨器、离心机、恒温水浴锅、烧杯、量筒、微波炉、离心管架、移液器(2.5 μL、10 μL、20 μL、100 μL、200 μL、300 μL、1 000 μL)、医用毛细管、一次性手套、卫生纸、Qubit®4.0荧光计、-20 ℃冰柜、4 ℃冰箱、振荡器、96孔PCR仪、qPCR仪、Ion Chef仪器、Ion Gene Studio S 5 prime测序仪。

1.3 方 法

1.3.1DNA的提取和质检

采用CTAB法提取102个样品的基因组DNA,用Qubit®4.0荧光计进行DNA质量检测和浓度测定。

1.3.2DNA工作液制备

使用Qubit®4.0荧光计(Thermo Fisher Scientific Company Carlsbad,USA)对上述DNA进行定量,每个样品使用10 ng的DNA。将待测样品的DNA溶液稀释到2.5 ng/μL,作为基因组DNA工作液待用。

1.3.3扩增体系和程序

多重扩增靶向捕获体系为20 μL,4 μL 5× Ion AmpliSeq HiFi Master Mix,10 μL 2× 1 011 InDel标记多重扩增预混引物,4 μL DNA工作液和2 μL无核酸酶水。

多重扩增程序如下:99 ℃ 2 min,99 ℃ 15 s的17个循环,60 ℃ 4 min,然后保持10 ℃不超过2 h。

1.3.4引物部分消化

多重扩增结束后用2 μL FuPa试剂对多重扩增靶向捕获产物进行部分消化引物,在SimpliAmpTM热循环仪上进行,程序如下:50 ℃ 10 min,55 ℃ 10 min,60 ℃ 20 min,最后10 ℃下保温不超过1 h。

1.3.5测序接头和Barcode的连接

加入Ion P 1 Adapter(测序接头)和Ion XpressTMBarcode(文库条形码),并加入DNA Ligase(DNA连接酶),连接反应也在SimpliAmpTM热循环仪上进行,程序如下:在22 ℃ 30 min,68 ℃ 5 min,72 ℃ 5 min,10 ℃下保温不超过2 h。

1.3.6文库的纯化和测序

利用Ion Library TaqMan定量试剂盒,在QuantStudio 6 Flex实时PCR系统上对构建的待测样品的多重扩增靶向捕获测序文库进行准确定量,再将文库统一稀释到100 pmol/L,然后取等量混合,取25 μL混合后的文库,利用Ion 540 KIT试剂套装在Ion Chef仪器进行自动化模板制备。

1.3.7类群分析

用PowerMarker 3.0软件计算系之间的遗传距离和遗传相似度,计算出的遗传距离用MEGA 7的UPGMA法构建系统进化树。

2 结果与分析

2.1 基因分型分析

在本实验中,利用多重靶向测序基因分型InDel试剂盒对102份供试材料进行InDel基因分型,共计获得7.8 G数据,大约60 M的reads,InDel标记的平均测序深度305倍,测序深度最高的达到1 500倍,个别InDel没有测序数据,说明玉米InDel靶向测序Panel还有优化空间。如图1(a)所示,在1 618个InDel标记中,510个InDel的基因分型成功率(Call Rate)为100%,基因分型成功率大于80%的总共有1 035个。基于InDel标记测序数据深度和基因分型成功率对玉米InDel标记靶向测序Panel进行优化,淘汰测序数据深度小于100倍和基因分型成功率低于80%的InDel标记。如图1(b)所示,获得一个包含1 011个InDel标记的玉米InDel标记靶向测序Panel,取名为MaizeIDP 1 K。

2.2 引物多态性

利用PowerMarker 3.0软件对1 270个InDel引物进行统计计算,等位基因数为2 540个,平均等位基因数为2个,总的基因型个数为3 810个,平均基因型个数为3个,多态信息含量PIC值为0.228 0～0.375 0,平均值为0.364 2。当PIC≥0.5时属于高度多态,0.25≤PIC<0.5属于中度多态,PIC<0.25属于低度多态[1]。InDel标记的PIC分析结果说明所选InDel标记主要是中度多态性标记(图2)。

图2 1 011个InDel标记组合的PIC值分布

2.3 聚类分析

利用构建的多重扩增靶向捕获测序InDel标记组合对102个玉米自交系材料进行基因分型,获得了1 011个InDel标记的基因分型数据。导入PowerMarker 3.0软件计算自交系材料间的遗传距离,将自交系材料间的遗传距离矩阵数据导入MEGA 7,利用UPGMA法构建了102个玉米自交系材料的聚类图。如图3所示,根据标准测验种所代表的中国玉米生产主要应用的杂种优势群,在聚类分析划分的群中包括以CML 162为代表的亚热带混血群,以昌7-2为代表的黄改群,以B 73为代表的瑞德群,以Mo 17为代表的兰卡斯特群,以丹340为代表的旅大红骨群,以X 178为代表的P群。利用1 101个InDel标记对102份自交系材料的杂种优势群划分结果,与现有的杂种群和已知谱系高度一致[74-75],说明利用InDel标记对玉米材料的杂种优势群分析是正确的,效果很好。结果证明InDel标记也适合类群划分,为InDel标记在其他作物的类群划分研究上的应用提供了参考依据。

注:图中分支的颜色代表了不同的杂种优势群,黄色代表黄改群,宝蓝代表亚热带混血群,绿色代表瑞德群,紫红色代表兰卡斯特群,蔚蓝色代表旅大红骨群,红色代表P群。

3 讨 论

对于InDel基因分型的方法来说,使用靶向测序比其他方法更具有高通量、省时、省事和性价比高等优点。郭子枫等[16]利用捕获测序技术开发了一系列具有不同标记数的玉米SNP标记Panel,并验证其效率。成本效益分析表明,其平台不仅适合不同的应用,而且育种者负担得起,特别是中小型公司和发展中国家。

杂种优势群的划分是新选、引育优良自交系的前提,种质改良和杂交组合的亲本选配之前必须要进行杂种优势的划分。故本试验利用多重靶向测序InDel标记组合对102个玉米自交系进行基因分型,从而对其进行杂种优势划分,其结果与系谱一致。