乳双歧杆菌冻干保护剂的研究及质量评价

竹磊

河南省商业科学研究所有限责任公司（郑州 450002）

乳双歧杆菌（Bifidobacterium lactis）又称动物双歧杆菌，是肠道中最典型的有益菌[1-3]，属于双歧杆菌属。典型的菌体形态有V形、Y形和曲状等，无鞭毛、不运动、无芽孢，对氧非常敏感[4]，主要存在于人类和哺乳动物肠道内，能定植于肠道且发挥益生功效，如调节肠道菌群、抑制有害菌生长[5]、降低胆固醇、增强机体免疫力[6]等。因其独特的益生功效，被广泛应用于食品、医疗保健、畜禽养殖等领域[7]。

在乳双歧杆菌的保存过程中，为防止菌体的衰老和死亡，通常通过去除菌体的水分阻止其新陈代谢，从而保存菌体[8-9]。乳双歧杆菌菌粉主要通过真空冷冻干燥技术实现，然而冷冻和干燥过程中会使细胞受到损伤、死亡及某些蛋白酶分子钝化[10-11]。如果菌体直接进行冷冻干燥，存活率很低，但若将菌体悬浮于适宜的介质中再进行冷冻干燥，可使菌体的存活率达到70%以上[12]。因此，选择合适的冻干保护剂非常必要。保护剂可以改变生物样品冷冻干燥时的物理、化学环境，减轻或防止冷冻干燥或复水对细胞的损害，尽可能保持原有的各种生理生化特性和生物活性[13]，还能保护乳酸菌抵抗不良环境，有效促进有益菌的生长，进而提高冻干粉中益生菌的存活率和保藏期间的细胞稳定性[14]。现有的冷冻干燥保护剂对于乳双歧杆

菌的活性有一定保护作用，但是在冷冻干燥工艺中活细胞损失较大，并不能很好地保持原有的各种生理生化特性和生物活性[15-16]。因此，为进一步提高乳双歧杆菌在冷冻及干燥等各种不利环境下的存活率，以乳双歧杆菌为研究对象，分析不同冻干保护剂对其存活率的影响，研制最佳的复合保护剂配方，并进行稳定性研究，以期提高菌体在冷冻过程中的存活率，为冻干益生菌的开发利用提供理论依据[17]。试验的冻干保护剂能将细胞和菌体最大面积地包裹在其中，减少细胞组织和菌体与氧气间接或直接接触，为细胞提供一个良好的休眠环境，因此能达到延长物料的储存期，使物料在一定时间内保持较高活性的效果[18]。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

乳双歧杆菌（ATCC 700541，中国工业微生物菌种保藏管理中心）；MRS培养基（青岛海博生物技术有限公司）；菊粉、海藻糖（上海源叶生物科技有限公司）；脱脂乳粉（内蒙古伊利实业集团股份有限公司）；半胱氨酸盐酸盐（天津市大茂化学试剂厂）。

YQX-Ⅱ厌氧培养箱（上海福玛实验设备有限公司）；LRH-550电热恒温培养箱（广东省泰宏君科学仪器股份有限公司）；BKQ-B75L灭菌器（山东博科消毒设备有限公司）；SCIENTZ-30YG/A真空冷冻干燥机（宁波新芝冻干设备有限公司）；85-2恒温磁力搅拌器（济南爱来宝仪器设备有限公司）；BSC-1500ⅡB2-X生物安全柜（济南鑫贝西生物技术有限公司）；DGG-9030A电热恒温鼓风干箱（上海昀冠机电设备有限公司）；HH-M6恒温水浴锅（江苏新春兰科学仪器有限公司）；HZ-9811K恒温振荡器（上海佐研仪器科技有限公司）。

1.2 试验方法

1.2.1 菌种扩大培养

将保藏的乳双歧杆菌（ATCC 700541）融化，取1 mL接种到MRS液体培养基中，在36 ℃静置培养8～12h，无菌生理盐水离心洗涤3次，用无菌水将菌悬液调至适宜浓度备用[19]。

1.2.2 离心条件的选择

将乳双歧杆菌培养液移入无菌离心管中，分别在4 000，6 000，8 000和10 000 r/min条件下离心10和20min；弃去上清液，收获菌体，生理盐水洗涤[20]。

1.2.3 保护剂的制备

取一定量的海藻糖、菊粉、玉米淀粉、半胱氨酸盐酸盐、脱脂乳粉溶于无菌水中，其中海藻糖、玉米淀粉、菊粉、脱脂乳粉在121 ℃灭菌20 min。半胱氨酸盐酸盐过滤除菌（0.22 μm微孔滤膜）。

1.2.4 单因素试验

研究采取测定不同菊粉添加量（0，2%，4%，6%和8%）、脱脂乳粉添加量（0，2%，4%，6%，8%和10%）、半胱氨酸盐酸盐添加量（0，0.2%，0.4%，0.6%和0.8%）和海藻糖添加量（0，3%，6%，9%和12%）对乳双歧杆菌存活率的影响。

1.2.5 正交试验优化复合保护剂配方

根据单因素试验结果，筛选出对冻干过程中菌体保护效果较好的保护剂。以真空冷冻干燥后菌体存活率为评价指标，通过正交试验对复合保护剂配方进行优化设计，以得到最佳复合保护剂配方[21]。

1.2.6 真空冷冻干燥

将乳双歧杆菌放入-80 ℃超低温冰箱中预冻2 h，预冻时要用保鲜膜将容器口封住，并在保鲜膜上扎一些小洞，经过2 h后取出，放入真空冷冻干燥机内，12h取出即可。测定真空冷冻干燥前后活菌总数，并计算存活率。

1.2.7 热环境的耐受性研究

取0.5 g真空冷冻干燥后的乳双歧杆菌，在30，50，60和70 ℃中水浴加热30 min后，在37 ℃，180r/min的恒温摇床中振荡培养2 h。测定乳双歧杆菌数量。

1.2.8 乳双歧杆菌的贮存稳定性

将制备好的乳双歧杆菌于不同温度条件下贮存，每15 d测1次活菌数，以此考察乳双歧杆菌的贮存存活率。

1.3 数据处理

采用Excel 2013、正交设计助手Ⅱ V3.1进行统计分析[22]。

2 结果与分析

2.1 离心条件的确定

离心是发酵剂制备过程中的关键步骤，因此试验对离心转数及时间对收获细胞浓度的影响进行试验性分析，具体结果见表1。

表1 离心条件对菌体细胞浓度的影响

表2 正交因素水平表 单位：%

由表1可以看出，离心转速4 000和6 000 r/min时，由于离心转速较低，有些小细胞不易被收集，但当离心转速达到10 000 r/min时，过高的离心转速和时间容易导致细胞的死亡[23]，使平板计数法测定的活细胞数较低，因此，较适宜的离心收集条件为8 000 r/min、20 min，此时收获的活细胞数是离心前的96.26%。

2.2 冻干保护剂单因素试验结果

2.2.1 菊粉添加量对冻干菌体存活率的影响

由图1可知，菊粉在冷冻干燥时对乳双歧杆菌起到明显的保护作用。菊粉添加量2%时，乳双歧杆菌菌体存活率达到最大值，继续增大菊粉添加量并不能提高其存活率。

图1 菊粉添加量对冻干菌体存活率的影响

2.2.2 脱脂乳粉添加量对冻干菌体存活率的影响

由图2可知，脱脂乳粉在冷冻干燥时对乳双歧杆菌具有明显保护作用。脱脂乳粉添加量小于6%时，随着脱脂乳粉的添加量不断增大，冻干后乳双歧杆菌的存活率不断增大，然而当达到6%后，脱脂乳粉的保护作用已达到最大，再增大其添加量，存活率也不会继续增加。

图2 脱脂乳粉添加量对冻干菌体存活率的影响

2.2.3 半胱氨酸盐酸盐添加量对冻干菌体存活率的影响

从图3可看出，当半胱氨酸盐酸盐添加量在一定范围内时，随着添加量的增大，冻干后菌体的存活率也随之提高。半胱氨酸盐酸盐添加量达到0.6%时，菌体存活率最高。半胱氨酸盐酸盐添加量继续增大，冻干后菌体的存活率反而有所下降。综上可得，半胱氨酸盐酸盐的最佳添加量为0.6%。

图3 半胱氨酸盐酸盐添加量对冻干菌体存活率的影响

2.2.4 海藻糖添加量对冻干菌体存活率的影响

由图4可知，海藻糖在冷冻干燥时对乳双歧杆菌起到明显保护作用。随着海藻糖添加量不断增大，菌体存活率增大，但当海藻糖添加量大于9%时，冻干菌体存活率降低。分析原因可能是，当海藻糖添加量较小时，随着添加量的增加[24]，海藻糖所形成的玻璃态越来越稳固，对菌体的保护作用也越来越大；但海藻糖添加量过高时，会加速细胞内蛋白质的聚合，不利于细胞的低温保存，从而导致菌体存活率出现下降现象。

图4 海藻糖添加量对冻干菌体存活率的影响

2.3 正交试验优化复合保护剂配方

根据单因素试验结果，以菌体存活率作为评价指标进行正交试验[25]。

利用直观分析法观察正交试验结果，从表3可以看出，影响菌体存活率的因素主次顺序是B（脱脂乳粉添加量）＞D（海藻糖添加量）＞A（菊粉添加量）＞C（半胱氨酸盐酸盐添加量）。即脱脂乳粉为最重要影响因素。同时可以确定复合冻干保护剂的最佳配方为A1B2C3D2，即菊粉2%、脱脂乳粉6%、半胱氨酸盐酸盐0.6%、海藻糖9%。

表3 正交试验方案结果表

表4 不同温度和时间下的乳双歧杆菌活菌数单位：CFU/g

2.4 验证试验

验证试验共进行3次，经真空冷冻干燥处理后，测得的菌体存活率分别为83.2%，83.9%和84.1%，平均值为83.8%，与预期结果基本一致。

2.5 热稳定性研究

加热处理是食品加工过程中常见的方式。然而益生菌在高温下存活率较低，导致其在食品中的应用受到限制。将冻干乳双歧杆菌（含保护剂）、冻干乳双歧杆菌（不含保护剂），置于30，40，50，60和70 ℃进行水浴加热30 min，研究热处理对乳双歧杆菌活力的影响，结果如图5所示。50 ℃加热处理后，菌体存活率差别并不明显。温度升高到60 ℃时，冻干乳双歧杆菌（含保护剂）存活率为75%和72%，而冻干乳双歧杆菌（不含保护剂）存活率为50%，表明冻干保护剂在热环境下对乳双歧杆菌有明显的保护效果，而不加保护剂直接冻干对菌体损伤较大，存活率较低。温度达到70 ℃时，与冻干乳双歧杆菌（不含保护剂）存活率相比，冻干乳双歧杆菌（含保护剂）的存活率较高（62%），进一步说明冻干保护剂能显著提高乳双歧杆菌在热处理条件下的生存能力，增强其耐热性。

图5 热处理对乳双歧杆菌活力的影响

2.6 不同温度和时间下的贮存稳定性

随着贮存时间的延长，乳双歧杆菌的活菌数逐渐下降。温度的不同对乳双歧杆菌的存活率也有一定影响[26]。其中，在-20 ℃条件下贮存乳双歧杆菌活菌数最高，贮存60 d后活菌数仍达6.78×109CFU/g。在4 ℃条件下贮存的乳双歧杆菌也具有很好的稳定性。而在20和37 ℃条件下贮存的乳双歧杆菌随着时间的延长，活菌数较-20和4 ℃下降快。由此可见，20和37 ℃条件下不利于贮存乳双歧杆菌。因此，选择-20 ℃条件下贮存乳双歧杆菌。

3 结论与讨论

益生菌产品面临的主要问题就是在制作、保存和应用过程中活菌数变少，存活率太低，达不到能发挥保健作用的最低剂量，导致益生菌的功效大打折扣。试验制备的冻干用复合保护剂采用多种活性组分，不添加任何化学合成物质，安全性高；提高乳双歧杆菌菌体存活率；后期稳定，能在常温下保持较高的存活率。乳双歧杆菌复合冻干保护剂最佳配方为菊粉2%，脱脂乳粉6%，半胱氨酸盐酸盐0.6%，海藻糖9%。对其冷冻干燥后，平均存活率可达83.8%。70 ℃条件下处理30 min，冻干乳双歧杆菌存活率达62%。添加冻干保护剂后明显提高乳双歧杆菌的热稳定性。在-20，4，20和37 ℃贮存60 d后，活菌数仍达109CFU/mL以上。因此，试验制备的冻干保护剂能提高乳双歧杆菌的存活率和稳定性，从而延长货架期。