地参发酵酒的挥发性成分分析和体外抗氧化活性研究

伍蓉，黄小兰，何旭峰，周祥德，熊双，张椿翊

重庆市万州食品药品检验所（重庆 404100）

地参为唇形科地笋属植物毛叶地笋Lycopus lucidusvar.hirtusRegel.的根茎，因其形状、营养与人参相似而得名，又名虫草参[1]，属食药两用植物，具有繁殖能力强、产量高及营养丰富等优点，在我国大部分地区都有种植[2]。食用地参具有生津开胃、益气养血、补肝肾两虚、强腰膝筋骨等功效[3]。目前，国内外对地参的营养成分、化学成分和生物活性[2,4-6]已有较全面的研究，其潜在的保健价值和应用价值也逐渐被人们所了解，但在其开发利用上仍以酱菜、油炸等粗放型加工方式为主，深加工利用不足。

研究表明，地参良好的抗氧化活性与其丰富的多糖[3,6]、酚类[7]物质有关。实验室在前期的研究中发现，重庆万州产地参中迷迭香酸、丹参素等酚酸类物质含量远远高于其他产地[8]，为地参的深加工奠定了理论基础。地参发酵酒是以重庆万州产地参和糯米为原料发酵制得，在发酵过程中，多糖类物质被微生物利用产生酒精，而酚类物质则得以保留并最大限度地释放到酒里，使地参发酵酒具有一定的保健价值。因此，研究将采用福林酚比色法测定地参发酵酒中总酚含量；顶空固相微萃取和气相色谱-质谱联用技术（Headspace solid phase microextraction and gas chromatography-mass spectrometry，HS-SPMEGC-MS）检测分析地参发酵酒中挥发性成分，为其特征香气成分的研究、风味调整奠定了基础。同时采用科学手段对地参发酵酒的还原力，羟自由基、DPPH自由基和ABTS自由基清除率等体外抗氧化活性指标进行测定，不仅为地参发酵酒的保健价值提供理论依据，也为地参的深度开发提供新思路。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

地参发酵酒（实验室自制）；1, 1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、2, 2’-联氮双（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二铵盐（ABTS），上海麦克林生化科技有限公司；没食子酸（99.0%，北京曼哈格生物有限公司）；抗坏血酸（优级纯，成都市科隆化学品有限公司）；硫酸亚铁、过硫酸钾、过氧化氢溶液、水杨酸、三氯化铁、铁氰化钾、三氯乙酸、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、无水碳酸钠、福林酚B液（1 mol/L），均为分析纯，成都市科隆化学品有限公司；水为实验室自制纯水。

1.2 仪器与设备

7000 C型气相色谱-质谱联用仪（美国安捷伦仪器公司）；顶空固相微萃取头（Divinylbenzenne/Carboxen/PDMS，50 μm，美国Supelco公司）；TU-1901型双光束紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）；HWS型电热恒温水浴锅（上海一恒科学仪器有限公司）；HB10型旋转蒸发浓缩仪（德国IKA公司）；SHAKERS型多位漩涡振荡器（德国海道夫公司）；Milli-Q Advantage A10型超纯水机（密理博中国有限公司）。

1.3 试验方法

1.3.1 地参发酵酒的制备

取鲜地参洗净泥沙，自然晾干水分至50%左右，打碎成米粒大小，与糯米按照一定比例混合，按工艺流程进行制备（酒曲接种量0.50%，发酵温度27 ℃，发酵时间9 d）。

1.3.2 总酚含量的测定

取20 mL地参发酵酒于离心管中，加入乙酸乙酯涡旋提取3次，每次20 mL，合并上层提取液于鸡心瓶中，40 ℃旋蒸蒸发至近干，残渣用甲醇溶解并转移至5 mL棕色容量瓶中，定容至刻度，摇匀，即得地参发酵酒总酚溶液。

采用福林酚比色法[9]测定总酚含量，并稍作修改。精密称取0.019 93 g没食子酸于100 mL棕色容量瓶中，用纯水溶解并定容，摇匀，即得质量浓度为0.197 mg/mL的没食子酸标准溶液。分别吸取0，0.05，0.10，0.15，0.20，0.25，0.30 mL上述溶液于10 mL比色管中，加4.00 mL纯水和0.10 mL福林酚B液，充分混匀，室温反应3 min，再加入0.60 mL 20%无水碳酸钠溶液，用纯水补至5.00 mL，摇匀，室温反应2 h，然后在波长760 nm处测定吸光度。吸取0.10 mL地参发酵酒总酚溶液于10 mL比色管中后，与没食子酸同法操作，带入标准曲线计算总酚含量。

1.3.3 挥发性成分的测定

1.3.3.1 样品溶液制备

精密吸取10 mL地参发酵酒样置于20 mL顶空瓶中，加入2.5 g NaCl，于保温套50 ℃加热平衡20 min后，将已老化好的萃取头插入顶空瓶中，纤维头位于液面上约1.0 cm，搅拌速度为500 r/min，吸附20 min。然后将萃取头插入气相色谱仪进样口，230 ℃解吸5 min，拔出萃取头时及时抽回纤维头，并启动采集数据。

1.3.3.2 气相条件

色谱柱为赛默飞石英毛细管柱TG-WAXMS（30m×250 μm×0.25 μm）；升温程序：初始温度40 ℃，保持3 min，以2 ℃/min升温至160 ℃，然后以5 ℃/min升温至240 ℃，保持20 min。载气：高纯氦气（纯度≥99.999%）；流速1.0 mL/min；进样口温度230 ℃。

1.3.3.3 质谱条件

离子源为电子电离源（electron ionization，EI），离子源温度240 ℃，传输线温度240 ℃，质量扫描范围m/z40～500，溶剂延迟时间5 min。

1.3.4 体外抗氧化活性的研究

1.3.4.1 羟基自由基清除率

参照Sankar等[10]的方法，分别吸取0.05，0.10，0.25，0.50，1.00，1.50和2.00 mL地参发酵酒，用纯水补至2.00 mL，依次加入FeSO4溶液（9 mmol/L）、水杨酸乙醇溶液（9 mmoL/L）和H2O2溶液（9 mmol/L）后摇匀，在37 ℃水浴加热15 min后测定吸光度Ai；以纯水代替样品作为空白对照，测得吸光度A0；为扣除地参发酵酒的本底颜色，除不加H2O2溶液外，其余操作同地参发酵酒样品，测得吸光度Aj；同时采用0.1%抗坏血酸溶液为阳性对照。羟自由基清除率按式（1）计算。

1.3.4.2 还原力测定

参照Prommaban等[11]的方法，分别吸取0.20，0.40，0.80，1.20，1.60和2.00 mL地参发酵酒，用纯水补至2.00 mL，依次加入2.5 mL磷酸盐缓冲液（0.2 mol/L，pH 6.6）和2.5 mL铁氰化钾溶液（10 g/L），摇匀，于50 ℃水浴加热30 min，取出迅速冷却，加入1 mL三氯乙酸（100 g/L），摇匀，静置10 min。取2.0 mL上述反应液加入0.5 mL三氯化铁（1 g/L），再加入3.5 mL纯水，振荡混匀，在700 nm波长处测定吸光度，同时采用0.1%抗坏血酸溶液为阳性对照，其吸光度大小表示还原力大小。

1.3.4.3 DPPH自由基清除率

参照Jo等[12]的方法，称取8.7 mg DPPH，用100.0 mL无水乙醇溶解，得0.2 mmol/L的DPPH溶液。取地参发酵酒，稀释5倍，分别吸取0.10，0.20，0.40，0.60，0.80，1.00和1.20 mL稀释样品，用纯水补至2.00mL，再分别加入2 mL DPPH乙醇溶液，振荡混匀，室温下避光反应30 min后在波长517 nm处测定吸光度Ai；以纯水代替样品为空白对照，测得吸光度A0，同时采用0.01%抗坏血酸溶液为阳性对照。DPPH自由基清除率按式（2）计算。

1.3.4.4 ABTS自由基清除率

参照国琦等[13]的方法，称取100.4 mg ABTS和17.2 mg过硫酸钾，用25.0 mL纯水溶解，室温下避光放置24 h，得ABTS+母液。临用时取适量ABTS+母液，用95%乙醇稀释至吸光度在0.70±0.02（λ=734 nm）范围内，作为ABTS+使用液。取地参发酵酒，稀释10倍，分别吸取0.02，0.04，0.08，0.12和0.16 mL稀释样品，用纯水补至1.00 mL，分别加入2 mL ABTS+使用液，振荡混匀，避光反应5 min，在波长734 nm处测定吸光度Ai；以纯水代替样品为空白对照，测得吸光度A0。ABTS+自由基清除率按式（3）计算。

1.4 数据处理

采用Microsoft Excel 2007软件对测定数据进行处理。

2 结果与讨论

2.1 地参发酵酒总酚含量结果

根据“1.3.2”小节，以没食子酸质量（X）为横坐标，吸光度（Y）为纵坐标，绘制标准曲线，得Y=0.015 74X-0.006 57（r=0.999 7），将地参发酵酒总酚溶液的吸光度带入没食子酸标准曲线，计算得出地参发酵酒中总酚含量为128.9 mg/L。

2.2 挥发性成分分析

地参发酵酒挥发性成分通过GC-MS分析，总离子流图如图1所示。物质出峰时间主要在5～70 min内，详细鉴定结果见表1。

表1 地参发酵酒挥发性成分的GC-MS鉴定结果

图1 地参发酵酒中挥发性成分总离子流图

由表1可知：共检出6类34种挥发性成分，主要为酯类17种、醇类8种、酸类3种、酰胺类3种、酚类2种和酮类1种。各类物质的相对含量见图2，分别为酯类26.44%，醇类59.03%，酸类1.55%，酰胺类3.45%，酚类9.45%和酮类0.07%。其中香气成分有24种，占比70.58%，包括醇类和酯类物质。其次是抗氧化成分，主要包含酚类和酰胺类。

图2 地参发酵酒不同种类挥发性物质的相对含量

通过面积归一化法计算各组分相对含量，结果显示，地参发酵酒检出的挥发性成分中，主要为苯乙醇、异戊醇、辛酸乙酯、2, 4-二叔丁基苯酚、乙酸异戊酯、己酸乙酯、乙酸苯乙酯和异丁醇，含量分别为30.01%，27.11%，11.56%，9.39%，6.75%，2.70%，2.62%和1.41%。其中醇类物质占总挥发物质的59.03%，主要以苯乙醇（占醇类的物质的50.80%）、异戊醇（占醇类的物质的45.90%）和异丁醇（占醇类的物质的2.39%）为主，苯乙醇[14]不仅存在于天然植物中，也是发酵产生的特征成分，具有柔和、愉快而持久的玫瑰花香，还兼具杀菌作用。异戊醇和异丁醇作为发酵产生的高级醇类物质，赋予地参发酵酒淡淡的茶香。

地参发酵酒中检出酯类物质最多，但从图2可看出其含量不及醇类高，仅占总挥发性物质的26.44%，但由于其嗅觉阈值较低[15]，因此对地参发酵酒的香气也产生了较大影响，是主要的呈香物质，包括辛酸乙酯、乙酸异戊酯、己酸乙酯、乙酸苯乙酯、癸酸乙酯和庚酸乙酯，分别占酯类物质含量的43.71%，25.50%，10.20%，9.92%，3.23%和1.11%。辛酸乙酯[16]具有类似白兰地的香气，略带甜味，是酒中重要的香气成分和风味化合物，其香气强度仅次于己酸乙酯。其他酯类物质相互影响、协同作用，赋予地参发酵酒多重花果香和酒香，使其风味独特，风格典型，口感饱满。其他物质有2, 4-二叔丁基苯酚[17]，含量为9.39%，是多种光稳定剂、抗氧化剂的重要中间体，可作抗氧剂、稳定剂、紫外线吸收剂，具有良好的抗氧化作用，可有效提高地参发酵酒的抗氧化能力。

2.3 体外抗氧化性

为了客观评价地参发酵酒的体外抗氧化能力，以不同浓度的抗坏血酸溶液作为阳性对照，以其当量进行表示。

2.3.1 羟自由基清除能力分析

羟自由基是活性氧中最活泼的自由基，可降解DNA、细胞膜和多糖化合物，是对活细胞破坏力最强的自由基之一，对机体危害较大[18]。试验利用水杨酸与羟自由基反应生成紫色化合物，在波长510 nm处产生最大吸收峰，测定地参发酵酒的羟自由基清除率，结果如图3所示。地参发酵酒和抗坏血酸的羟自由基清除率随样品用量的增加而增大。在0.20～1.00 mL时，地参发酵酒的清除率上升速度较抗坏血酸快；在1.50 mL时，地参发酵酒达到较高的自由基清除效果，清除率为98.50%，此时0.1%抗坏血酸的清除率为99.87%。以抗坏血酸当量表示，地参发酵酒的羟自由基清除能力为0.986 mg/mL，即1 mL地参原酒的羟自由基清除能力相当于0.986 mg抗坏血酸，与其他发酵酒相比，地参发酵酒清除羟自由基的能力优于发酵型枳椇子黄酒[17]。

图3 地参发酵酒羟自由基清除能力分析

2.3.2 还原力分析

还原力作为判断物质抗氧化能力的重要指标，其作用机理主要是具有强还原力的物质可提供电子，一方面还原体内氧化性物质，另一方面与自由基反应生成稳定物质，从而达到抗氧化的目的[19]，吸光度越大表明还原力越强。如图4所示，地参发酵酒用量与吸光度呈良好线性关系（R2=0.998 8），还原力随用量的增加呈上升趋势。在2.00 mL时，吸光度较高，为1.973。抗坏血酸在0.20～0.80 mL范围内呈现良好的线性关系（R2=0.998 2），但随着用量的继续增加，还原力趋于稳定，最高吸光度为2.423。以抗坏血酸当量表示，地参发酵酒的还原力为0.814 mg/mL，即1 mL地参原酒的还原力相当于0.814 mg抗坏血酸，明显高于黑菊芋酒[14]。

图4 地参发酵酒还原力分析

2.3.3 DPPH自由基清除能力分析

自然界中大部分自由基都具有活性强、寿命短的特征，而DPPH自由基则是一种以氮为中心的、稳定的有机自由基，在物质抗氧化性检测中应用广泛[20]。试验利用DPPH体系对地参发酵酒清除自由基能力进行研究，结果如图5所示。当用量为0.10～0.20 mL时，地参发酵酒与抗坏血酸对DPPH自由基的清除率相当。随着用量的增加，二者的清除率迅速提高，在0.20～0.60 mL时，抗坏血酸的提升速率较地参发酵酒快。当用量为0.60 mL时，抗坏血酸清除率达到最大，为90.90%，地参发酵酒则在0.80 mL时达到较高清除率90.30%，清除能力优于地参多酚[21]。以抗坏血酸当量表示，地参发酵酒原液的DPPH自由基清除率为0.373mg/mL，即1 mL地参原酒的DPPH自由基清除能力相当于0.373 mg抗坏血酸。

2.3.4 ABTS自由基清除能力分析

ABTS与过硫酸钾反应生成稳定的蓝绿色ABTS+，当样品中的抗氧化活性成分与ABTS+结合时，可使蓝绿色褪去，因此可用ABTS+清除率来评价物质的抗氧化能力[22]。地参发酵酒对ABTS自由基清除率如图6所示。当用量为0.02～0.16 mL时，地参发酵酒对ABTS+的清除率随着样品用量的增加而增大，在0.16 mL时达到较高清除率97.00%，抗坏血酸在0.08 mL达到较高清除率95.26%后增幅不大。以抗坏血酸当量表示，地参发酵酒的DPPH自由基清除率为0.510 mg/mL，即1 mL地参原酒的DPPH自由基清除能力相当于0.510 mg抗坏血酸。

图6 地参发酵酒ABTS自由基清除能力分析

3 结论

研究通过顶空固相微萃取和气相色谱-质谱联用技术对地参发酵酒中挥发性成分进行检测分析，共鉴定出挥发性成分34种，主要包含酯类、醇类、酸类、酰胺类、酚类和酮类等6类化合物。其中香气成分24种，占比70.58%，相对含量较高的有苯乙醇、异戊醇、辛酸乙酯、乙酸异戊酯、己酸乙酯、乙酸苯乙酯和异丁醇。其次为抗氧化成分，主要有2, 4-二叔丁基苯酚等化合物。体外抗氧化试验表明，在一定范围内，还原力吸光度和自由基清除率与地参发酵酒用量呈现良好的正相关关系，随后趋于稳定。对羟自由基、DPPH自由基和ABTS自由基的清除率分别为98.50%，90.30%和97.00%。以抗坏血酸当量衡量地参发酵酒在不同体系中的抗氧化能力大小，顺序为羟基自由基＞还原力＞ABTS自由基＞DPPH自由基。地参发酵酒中香气成分丰富，富含多酚等天然抗氧化物质，抗氧化活性强，保健价值突出，具有广阔的市场前景，可作为一款新型保健酒进行推广，丰富发酵酒市场，让地参产生更大的经济效益和社会效益。