枇杷果酒发酵过程中理化及风味成分分析

单硕，常国立，吴刚正，朱瑞瑜，蔡海莺，蔡成岗

1. 浙江科技学院 生物与化学工程学院（杭州 310023）；2. 浙江省农产品化学与生物加工技术重点实验室 浙江省农业生物资源生化制造协同创新中心（杭州 310023）

枇杷（Eriobotrya japonicaLindl.）是我国传统名果[1]，每年五六月份为盛产的季节，成熟的枇杷味道甜美柔软多汁，风味酸甜，口味甘甜，肉质细腻，营养颇丰，包括果糖、葡萄糖、钾、磷、铁、钙以及维生素A、B、C等营养成分[2]，其中胡萝卜素含量在各水果中为第三位。枇杷可以作为药物使用，具有清肺、止咳、舒气、解署、益寿等功能，同时对增进食欲，失眠也有一定的疗效。但枇杷上市时间短，不易保鲜，需要进行深度加工以发挥其价值，制备成发酵果酒为深加工的方向之一。以新鲜枇杷为原料，接种酵母菌发酵后可以制备成枇杷酒，含有的胡萝卜素可以保护视力，保持肌肤健康；有机酸类成分可增进食欲，帮助消化，多酚类抗氧化成分可预防癌症，延缓衰老[3]，同时还含有丰富的维生素、糖类、钙、镁等营养元素。Feng等[4]在桑葚果酒中检测到31种香味物质，其中醛类2种、酸类4种、酯类13种、醇类13种。在发酵过程中，酵母菌的数量对发酵过程影响较大，其快速增殖影响到发酵液中的风味物质和酒精含量，对其他发酵过程中的理化指标也有较大的影响。

此试验通过添加不同比例酵母菌，研究枇杷果酒发酵过程中主要理化指标的变化，以期初步揭示枇杷果酒发酵过程中主要物质的变化规律，从而为枇杷果酒发酵过程的控制提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

枇杷（白沙种，杭州市农副产品物流中心）；安琪活性干酵母（当地超市）；牛血清白蛋白、考马斯亮蓝G-250、甲醇、乙醇、磷酸、葡萄糖、苯酚、浓硫酸、1, 1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、三羟甲基氨基甲烷盐酸缓冲溶液（Tris-HCl）、酪氨酸、茚三酮（分析纯，阿拉丁生化试剂公司）。

1.2 仪器与设备

AP-TD55糖度计（衢州艾普计量仪器有限公司）；SpectraMax190酶标仪[美谷分子仪器（上海）有限公司]；7890A-5975C气相质谱-质谱仪（美国安捷伦公司）；TP-350E数显磁力加热搅拌器（杭州米欧仪器有限公司）；ME104E分析天平（梅特勒公司）；SP-752紫外分光光度计（上海光谱仪器有限公司）；ZZ-SPME-06固相微萃取探针（贞正分析仪器有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 枇杷果酒制备工艺

枇杷清洗→去核→榨汁→过滤→调整糖度→酵母活化→接种→发酵→枇杷果酒→指标分析

1.3.2 操作要点

将枇杷去核、破碎打浆后过滤得到枇杷汁，向果汁中添加白砂糖使枇杷果汁糖度达到200 g/L，以枇杷汁总重1%，3%和5%的比例接入活化好的酵母（20%的蔗糖水溶液300 mL，灭菌冷却后加入10 g活性干酵母，摇匀静置30 min），在26 ℃下静置发酵。发酵过程中每5 d取样测定枇杷果酒中的总糖、可溶性蛋白质和氨基酸含量，以DPPH法测定自由基清除率，并采用GC-MS进行风味成分分析。

1.3.3 总糖检测

取发酵果酒，稀释至合适浓度，采用苯酚硫酸法[5]测定总糖含量（以葡萄糖计）。回归方程为y=0.666 2x+0.116（R2=0.996 9），如图1所示。

图1 总糖含量的标准曲线

1.3.4 可溶性蛋白的检测

可溶性蛋白测定采用考马斯亮蓝法[6]。回归方程为y=0.333 9x-0.003 8（R2=0.999 1），如图2所示。

图2 可溶性蛋白含量的标准曲线

1.3.5 氨基酸检测

氨基酸总量以茚三酮比色法进行定量[7]，标准曲线以酪氨酸进行测定。回归方程为y=0.333 9x-0.003 8（R2=0.999 1），如图3所示。

图3 游离氨基酸含量的标准曲线

1.3.6 DPPH自由基清除率分析

DPPH清除率参考文献[8]的方法，稍作修改。将40 μL样品加去离子水至2 mL，再加入4 mL 0.1 mmol/L DPPH-甲醇溶液，再加入450 μL 0.1 mmol/L Tris-HCl缓冲液（pH 7.4），在25 ℃水浴锅中保温0.5 h。以维生素C为对照，以蒸馏水为参比，测试波长517 nm的吸光度，按式（1）计算。

式中：A0为空白对照液的吸光度；A1为样品测定管的吸光度；A2为样品本底管的吸光度。

1.3.7 枇杷酒发酵过程中香气成分的检测方法

样品吸附之前先将固相萃取头高温活化30 min，至无色谱峰出现为止。量取3 mL枇杷酒样于5 mL顶空瓶中，插入固相微萃取装置露出萃取头，保证刚好置于液面上方，将其放在温度为50 ℃的磁力搅拌器中30min，萃取结束后立即插入气相色谱仪进样口。

1.3.8 气相色谱条件

采用了王锦涛[9]的方法，稍作修改。色谱条件：色谱柱为TG-5MS石英毛细柱（30 m×0.25 mm×0.25μm）；1.0 mL/min氦气（99.999%）为载气；进样口温度设定为260 ℃，15 min解析，分流比设定为10∶1。色谱柱升温程序：起始温度为40 ℃，保持5 min，再以5 ℃/min的速度升温至200 ℃，保持1 min，再以10℃/min的速度升温至230 ℃，保持5 min。质谱条件：70 eV的EI离子源，温度为280 ℃，扫描范围为35～400 AMU，灯丝流量为0.25 mA，检测器电压为350 V。

2 结果与分析

2.1 枇杷果酒发酵过程中葡萄糖的变化

由图4可知，接种不同比例酵母的枇杷果酒中的葡萄糖在前5 d迅速下降，后缓慢下降直至平衡，随着发酵进程，酵母能利用的糖类物质逐步减少，最终趋于平衡。添加5%的酵母菌总糖含量略高，可能是由于加入菌种时糖含量较高，并且酵母在发酵后期可能存在自溶现象，细胞壁多糖等成分溶解在枇杷酒后对总糖含量有一定的影响。

图4 发酵过程总糖的变化

2.2 枇杷果酒发酵过程中可溶性蛋白质的变化

由图5可知，发酵前5 d可溶性蛋白质无明显变化，在5～10 d迅速下降，可溶性蛋白质作为氮源被酵母菌消耗，10 d后基本达到稳定。

图5 发酵过程中可溶性蛋白含量的变化

2.3 枇杷果酒发酵过程中游离氨基酸的变化

由图6能看出，发酵10 d后枇杷果酒中游离氨基酸开始呈现增加趋势，可能是因为酵母在发酵过程中利用蛋白质产生部分氨基酸，至发酵20 d后氨基酸又呈现增加趋势，可能是由酵母自溶所致。

图6 发酵过程中游离氨基酸含量的变化

2.4 枇杷果酒发酵过程中DPPH的变化

由图7可知，DPPH清除率总体呈下降趋势，表明随发酵进行枇杷果酒的抗氧化性减弱，有研究表明，DPPH自由基清除能力也呈先上升后下降的趋势，在发酵时间40 h时达到最大[10]，试验发酵周期长，DPPH自由基清除能力呈现下降趋势，跟发酵过程中营养物质减少进而影响发酵进程有关，进而导致DPPH自由基清除率随发酵时间的增加而下降。

图7 发酵过程中DPPH清除率的变化

2.5 枇杷果酒发酵过程中风味成分分析

2.5.1 不同发酵时期枇杷酒风味成分的总离子流图

枇杷酒发酵样品的总离子图如图8所示。在发酵过程中枇杷酒的香气成分变化很丰富，不同物质的分离度、峰形、离子峰度均较好。

图8 发酵25 d枇杷酒香气的总离子流图

2.5.2 不同发酵时期枇杷酒风味成分及其相对含量

不同发酵时期枇杷酒中的主要风味物质如表1所示。由表1可知，不同发酵时期的香气成分主要为酯、醇、醛3大类，包括苯甲醛、乙醇、苯乙醇、1-庚醇、2-甲基-1-丙醇、3-甲基-1-丙醇、2-甲基-1-丁醇、3-甲基1-丁醇，乙酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯等。由此表明，在枇杷果酒发酵期间，香气变化的同时保持前后的一致性，与蒲彪等[11]研究结果在多种成分上有一定的相似性。

表1 不同时期不同酵母接种量枇杷酒主要香气成分及其相对含量

2.5.3 不同发酵时期不同浓度枇杷酒香气成分分析

枇杷酒中香气成分按化合物结构分为醇类、酯类、酚类、醛类。枇杷酒中各类香气成分的相对含量高低依次均为醇类、酯类、醛类，其中又以醇类和酯类的相对含量较高，不同发酵时期以及添加不同量的酵母菌对三大类风味成分的影响如图9所示。在发酵第5天时，添加1%，3%和5%的酵母后，枇杷酒中的醇类成分差异不明显，酯类成分以3%和5%酵母添加量影响较大，说明酵母数量多促进了酯类成分的形成；在发酵第15天时，不同酵母添加量的枇杷酒中醇类物质含量存在了明显的区别，说明了酵母添加量高促进了更多的醇类物质生成；在发酵第25天时，三组发酵枇杷酒中的醇类物质含量在同一水平。此试验中醇类物质含量较高，对枇杷酒口味影响较大；张丽萍等[12]也报道醇类物质对枇杷酒香气的贡献最大。

图9 不同发酵时期以及添加不同量的酵母菌对三大类风味成分的影响

3 结论

试验通过比较不同酵母接种量以及不同发酵时期枇杷果酒理化与风味成分的变化，以期为枇杷酒的酿制提供一定的基础。试验结果表明：发酵过程中，总糖含量逐步呈现下降的趋势，后期略有升高；可溶性蛋白质含量在发酵10 d后即进入达到稳定；游离氨基酸含量同样在10 d后达到一个转折性的变化，即含量明显开始随发酵上升，部分试验的结果可能涉及酵母菌在发酵过程中营养不足时出现的自溶现象。DPPH自由基的清除效果随着发酵过程逐步下降。发酵枇杷酒风味独特，通过GC-MS分析发现以醇、酯类化合物为主要香气成分，不同发酵阶段醇类物质随着添加酵母的不同量有一定变化，最终处于同一水平，因而需要对添加不同酵母菌浓度后枇杷酒发酵的时间和进程进行控制，以期获得风味更好的枇杷酒产品。综上，枇杷为我国南方特色水果，储存期短，发酵制备的枇杷酒风味独特，研究通过酿造过程中理化指标和风味的变化分析，为枇杷酒的其进一步规模化开发提供了一定思路。