生脉饮中4 种植物生长延缓剂残留量检测方法研究

胡亮，周明，文庆，孙辉，丁野，罗疆南

1.湖南省药品检验检测研究院，湖南省药品质量评价工程技术研究中心，湖南 长沙 410001；2.湖南省药品审核查验中心，湖南 长沙 410013；3.湖南省药品审评与不良反应监测中心，湖南 长沙 410013

生脉饮来源于《医学启源》中生脉散，质量标准收载在《中国药典》2020 年版一部，具有益气复脉，养阴生津的功效，处方包括红参、麦冬、五味子3味药材，主要用于气阴两亏，心悸气短，脉微自汗［1-3］。本品处方中麦冬药材为百合科植物麦冬Ophiopogon japonicus（L.f）Ker-Gawl.的干燥块根，具有养阴生津，润肺清心之功效，主治肺燥干咳，喉痹咽痛，津伤口渴，内热消渴等［3］。目前麦冬药材多为栽培品，其在栽培过程中可能使用“壮根灵”类植物生长调节剂如多效唑、丁酰肼、矮壮素、缩节胺，这些成分能够显著促进麦冬块根的形成，从而达到增加产量目的［4-7］。QuEChERS 法是一种最先应用于果蔬中的农药残留量检测前处理方法，即Quick、Easy、Cheap、Effective、Rugged、Safe 英文字母的缩写，这种方法具有简单有效、安全快速的特点，非常适合于基质复杂的样品前处理，已经广泛应用于农残检测的样品前处理中［8-10］。《中国药典》2020 年版四部通则“2341 农药残留量测定法”中亦有收载［11］。

药材中残留的生长调节剂随着加工生产而转移到成方制剂中，目前成方制剂中生长调节剂残留量检测方法报道较少。本实验研究中生脉饮样品因其含有多种成分，如多糖类、黄酮类、皂苷类等，且基底较为复杂，因此采用QuEChERS 法对样品进行前处理，应用超高效液相色谱-质谱/质谱（UPLCMS/MS）技术，建立了样品中4 种植物生长延缓剂残留量的检测方法，结果部分批次样品中检出多效唑，均未检出丁酰肼、矮壮素、缩节胺，同时对检出多效唑成分样品进行了方法学验证，并对样品的检测结果进行分析讨论，为成方制剂中植物生长延缓剂残留量检测及限度制定提供了一定的参考依据。

1 仪器与试药

Thermo UltiMate3000 超高效液相色谱仪，TSQ Endura 三重四极杆式质谱系统，METTLER AE240电子分析天平（梅特勒-托利多，万分之一），XSE205DU 电子分析天平（梅特勒-托利多，十万分之一），超声仪KQ500DE（500 W，40 KHz）；多效唑对照品（批号：G752717，纯度：99.6%），丁酰肼对照品（批号：G160456，纯度：98.9%），矮壮素对照品（批号：G738578，纯度：99.4%），缩节胺对照品（批号：978380，纯度：96.1%）均购自Dr.Ehrenstorfer GmbH；WondaPak QuEChERS 醋酸钠提取包和固相萃取净化管（日本Shimadzu 公司）；乙腈、甲酸、乙酸铵均为色谱纯，其他试剂如甲醇、冰醋酸等为分析纯，水为纯化水。本研究共收集136 批次样品，来源为国家药品监督管理局生脉饮品种抽验工作抽验样品。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱为Ultimate LP-C18 柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）；以乙腈-0.1% 甲酸的5 mmol/L 乙酸铵溶液（55∶45）为流动相，柱温为30 ℃，流速为0.2 mL/min，进样量3 μL。

2.2 质谱条件

采用电喷雾正离子（ESI+）模式，喷雾电压为3.8 kV，鞘气为30 ARB，辅助气为10 ARB，离子传输管温度350 ℃，蒸发温度300 ℃，扫描模式为多反应监测MRM。多效唑选择m/z 294.0 →70.2、125.0作为检测离子对，碰撞能量分别为20 V、36 V；丁酰肼选择m/z 161.0 →61.3、143.0 作为检测离子对，碰撞能量均为10 V；矮壮素选择m/z 122.1 →58.3、62.3 作为检测离子对，碰撞能量分别为27 V、21 V；缩节胺选择m/z 114.2 →58.3、98.2 作为检测离子对，碰撞能量分别为25 V 和26 V；碰撞气体为高纯度氩气。取对照品溶液，进样3 µL，按上述离子对测定的MRM 色谱峰的信噪比均应大于10∶1。

2.3 对照品溶液的制备

分别精密称取多效唑对照品、矮壮素对照品、丁酰肼对照品和缩节胺对照品适量，置同一100 mL容量瓶中，用甲醇溶解定容，得到混合对照品溶液①（每1 mL 含多效唑107.8 μg、矮壮素104.8 μg、丁酰肼104.1 μg 和缩节胺136.4 μg），精密吸取混合对照品溶液①1 mL 置于100 mL 量瓶中，用甲醇稀释到刻度，摇匀，得到混合对照品溶液②（每1 mL 含多效唑1.078 μg、矮壮素1.048 μg、丁酰肼1.041 μg、缩节胺1.364 μg）。

2.4 供试品溶液制备

精密量取生脉饮样品15 mL，置50 mL 聚苯乙烯具塞离心管中，精密加入含1%冰醋酸的乙腈15 mL，置于振荡器上剧烈振荡5 min（1 500 次/min），于冰浴中冷却约30 min；加入QuEChERS 提取包，含无水硫酸镁与无水乙酸钠的混合粉末（4∶1，m/m）7.5 g，立即摇散，然后在振荡器上剧烈振荡5 min（1 500 次/min），离心5 min（8 000 r/min）。取上清液10 mL，置于已预先装有净化材料的分散固相萃取净化管中，净化管中加入QuEChERS 的净化包［含无水硫酸镁900 mg，N-丙基乙二胺（PSA）300 mg，十八烷基硅烷键合硅胶300 mg，硅胶300 mg，石墨化炭黑90 mg］，通过涡旋使其充分混匀，再置于振荡器上剧烈振荡5 min（2 000 次/min）使净化完全，离心5 min（8 000 r/min）；取上清液，滤过，即得供试品溶液。

2.5 样品中4 种植物生长延缓剂筛查

14 批次生脉饮样品检出多效唑，检出率为10.3%，均未检出丁酰肼、矮壮素和缩节胺。检出样品涉及4 家生产企业，检出多效唑典型色谱图见图1。同时，对检出多效唑成分的样品进行了方法学验证。

图1 生脉饮样品中4种植物生长延缓剂筛查结果：A.混合对照品溶液；B.阳性样品溶液

2.6 多效唑方法学验证

2.6.1专属性试验以供试品溶液中未检出多效唑成分的样品作为阴性对照溶液，检出多效唑成分的样品作为阳性供试品溶液。实验结果表明，阳性样品溶液色谱保留时间、提取离子流色谱图与多效唑对照品色谱行为一致，阴性对照溶液在相应的位置上无提取离子色谱峰，方法专属性较好。详见图2。

图2 多效唑专属性试验考察结果：A.多效唑对照品溶液；B.阴性对照溶液；C.阳性样品溶液

2.6.2线性关系考察精密量取“2.3”项下多效唑对照品溶液②（1.078 μg/mL）适量，加甲醇稀释，分别得到不同浓度的多效唑对照品溶液（431.2、215.6、107.8、43.12、21.56、5.39 ng/mL），按上述拟定的色谱条件精密吸取不同浓度对照品溶液各3 µL，注入液质联用仪，测定。以m/z 249.0 →70.2峰面积值为纵坐标，质量浓度为横坐标，绘制标准曲线，计算回归方程：Y=7 462.2X+55 189，r=0.997 5，表明多效唑在5.39～431.2 ng/mL 范围内线性关系较好。

2.6.3精密度试验精密吸取“2.6.2”项下的多效唑对照品溶液（215.6 ng/mL）3 µL，注入UPLC-MS/MS仪，连续采集6 针，测定m/z294.0 →70.2 离子流色谱峰面积，RSD 为3.4%，结果显示仪器精密度良好。

2.6.4重复性试验取生脉饮样品（商丘××有限公司，批号：19041331）适量，按“2.4”项下供试品制备方法平行提取6 份供试品溶液。精密吸取供试品溶液3 µL，注入超高效液相色谱-质谱联用仪，测定m/z294.0 →70.2 的离子流色谱峰面积，并计算样品中含量。经检测，样品中多效唑的平均含量为16.36 ng/mL，RSD 为2.8 %，表明方法重复性良好。

2.6.5稳定性试验取重复性试验项下供试品溶液，常温保存，于制备后0、6、12、18、24 h 分别进样分析，测定m/z 294.0 →70.2 离子流色谱峰面积，RSD 为2.9%，供试品溶液在24 h 内具有良好的稳定性。

2.6.6加样回收率试验精密量取生脉饮阴性样品15 mL，平行操作取样6 份，置已精密加入浓度为107.8 ng/mL 的多效唑对照品溶液1 mL 经过氮气吹干后的聚苯乙烯具塞离心管中，按拟定的方法平行制备供试品溶液。精密吸取3 µL，注入超高效液相色谱-质谱联用仪，测定，以m/z 294.0 →70.2 的离子流色谱峰面积计算加样回收率，多效唑回收率范围为90.2%～97.7%，平均回收率为93.3%，RSD为3.0%，表明方法回收率较好。

2.6.7检测限以m/z294.0 →70.2 作为检测离子对进行检测，取多效唑对照品溶液逐级稀释，注入超高效液相色谱-质谱联用仪，当其信噪比约为3∶1时计算检测限，结果为0.18 pg。

2.7 样品测定

136 批次样品中有14 批次检出多效唑，检出率为10.3%，涉及4 家生产企业，检出范围为10.2～121.9 ng/mL，具体检出结果见表1。

表1 136批次生脉饮样品中多效唑检出结果表

查阅相关文献［5-6］，麦冬药材中多效唑使用较为频繁。本研究按麦冬中多效唑0.5 mg/kg（水果谷物中最高残留限量为0.2～0.5 mg/kg）进行折算，生脉饮中多效唑含量应不得过100 ng/mL，结果检出的14 批次样品中2 批次超出拟定限度。

3 讨论

在整个麦冬药材种植过程中，植物生长延缓剂多效唑的使用比较普遍，也比较频繁。植物生长延缓剂属于农药，在不同国家的瓜果蔬菜中都有相应的残留量规定，由于多效唑在土壤中有较长的半衰期，因此存在危害非靶标的可能性。日本、韩国、新西兰、澳大利亚等国规定多效唑的最高残留限量（MRL）为0.5 mg/kg，我国对水果谷物类多效唑的MRL 规定为0.2～0.5 mg/kg［12-14］，对于中药材和中成药的残留量暂时没有相关规定。

参考食品中农药最大残留限量标准（GB 2763-2021），对于生脉饮样品中检出多效唑的情况计算每日安全服用量：

ADI：每日允许摄入多效唑量；W：使用者体重。

N：多效唑残留浓度（mg/kg）；O：使用原药材量（kg）。

以每日允许摄入多效唑量（Acceptable Daily Intake）0.1 mg/kg×体重作为基准，依据《中国药典》2020 年版一部麦冬项下最大使用量12 g、水果谷类多效唑最高残留限量0.5 mg/kg 计算，按照成人体重暂以50 kg 折算，麦冬药材成人每日最大安全服用量为10 kg，为药典规定用量（12 g）的800 多倍。

整体而言，生脉饮样品中检出多效唑批次较少，可能与样品生产工艺（渗漉提取）、麦冬药材中多效唑含量不高等因素有关。按照成人体重50 kg 计算，多效唑每日允许摄入量为5 mg，生脉饮样品规格为每支10 mL，用法用量为一次一支，一日三次。按每日最大服用量30 mL，样品中多效唑最大含量121.9 ng/mL 计算，每日摄入量为3.657 μg，远低于每日允许摄入量，从分析数据看样品中检出多效唑成分对人体的危害风险较低。但药品与食品相比，具有特殊性，多效唑在体内的具体作用机制尚不明确，是否存在与各药味中化学成分间相互反应有待进一步地考证。为更好地对中药安全性进行监测，应尽快完善并及时颁布植物生长调节剂残留量安全标准。植物生长调节剂多效唑的体内作用效果及作用机制等问题需要科学、严谨的实验研究，在保障人民群众用药安全的前提下，更好地促进中药产业链的健康持续发展。