小儿感冒颗粒中香芹酮检查方法研究

万莉，阳文武，向春艳，袁林

重庆市万州食品药品检验所，三峡库区道地药材开发利用重庆市重点实验室，重庆 404000

小儿感冒颗粒是由广藿香、薄荷、连翘、板蓝根、地骨皮、菊花、大青叶、地黄、白薇、石膏十味中药制成的中成药，具有疏风解表，清热解毒止痛之功效［1］。其中薄荷具有疏风的功效，是小儿感冒颗粒处方中的重要药材。留兰香作为薄荷同属的植物，其外观和气味与薄荷非常相似，难以分辨，近年来成为薄荷的常见易混品。而二者在化学成分、功效及应用领域上均有明显差异［2］，不能混用。留兰香的主要成分为香芹酮；薄荷的主要成分为薄荷脑且不含香芹酮。香芹酮是区别薄荷与留兰香的指标性成分［3］。本研究根据此特性，采用气相色谱法对小儿感冒颗粒中香芹酮进行检测，结果在部分小儿感冒颗粒中检出了留兰香指标性成分香芹酮，说明有必要建立小儿感冒颗粒中香芹酮的检查方法，对薄荷进行质量控制。

1 实验部分

1.1 仪器与试药

气相色谱仪（岛津GC-2010Plus，配置FID 检测器，日本岛津公司）；气相-质谱联用仪（赛默飞TSQ-9000-trace1300，美国赛默飞公司）；ME204T/02、MSE225S 电子天平［梅特勒-托利多科技（中国）有限公司］。薄荷脑、香芹酮对照品（批号分别为：110728-201707、E0019363，纯度分别为99.8%、98.2%，分别购自中国食品药品检定研究院和北京曼哈格生物科技有限公司）；留兰香、薄荷对照药材（批号分别为：310043-202206、120916-202113，分别购自中国食品药品检定研究院和上海鸿永生物科技有限公司）；经鉴定的广藿香、连翘、板蓝根、地骨皮、薄荷、菊花、大青叶、地黄、白薇、石膏药材均来自市售；乙酸乙酯为分析纯，水为自制纯化水。小儿感冒颗粒均来自市售，由15 个厂家生产共20 批，见表1；相关阴性样品为自制。

表1 样品信息

1.2 溶液制备

1.2.1供试品溶液取小儿感冒颗粒研细，称取7 g（相当于处方中薄荷0.4 g）置具塞锥形瓶中，精密加入乙酸乙酯20 mL，密塞，称定重量，超声处理（功率300 W，频率40 kHz ）20 min，放冷，再称定重量，用乙酸乙酯补足减失的重量，滤过，取续滤液作为供试品溶液。

1.2.2对照品溶液分别精密称取香芹酮、薄荷脑对照品适量，加乙酸乙酯溶解，得浓度分别为501.32、214.08 μg/mL 的对照品贮备溶液。精密量取贮备溶液各5 mL，加乙酸乙酯定容至50 mL，摇匀，得浓度分别为50.13、21.41 μg/mL 的混合对照品溶液。

1.2.3对照药材溶液取留兰香、薄荷对照药材各1 g，分别加水200 mL，并在挥发油测定器中加入乙酸乙酯2 mL，照挥发油测定法（《中国药典》2020 年版四部通则2204［4］）保持微沸2.5 h，分取乙酸乙酯层作为对照药材溶液。

1.2.4阴性样品溶液按小儿感冒颗粒的处方比例，取除薄荷外的其他药材制备阴性样品溶液。

1.3 气相色谱法（GC 法）

1.3.1色谱条件色谱柱为HP-5（5%二苯基-95%二甲基聚硅氧烷固定液，30 m×0.32 mm×0.5 μm）；流速为1.0 mL/min；进样口温度200 ℃；FID 检测器温度230 ℃；分流比10∶1；程序升温（初始温度90 ℃，保持3 min，以30 ℃/min 的速率升温至160 ℃，保持8 min，再以10 ℃/min 的速率升温至180 ℃保持2 min）；进样量1 μL。

1.3.2专属性考察取“1.2”项下的4 类溶液分别进样，在“1.3.1”项规定的色谱条件下检测，结果见图1。由色谱图可见，检出香芹酮的小儿感冒颗粒（以下称为阳性样品）在香芹酮对照品保留时间处出现相应的色谱峰，薄荷药材、薄荷脑对照品及阴性样品在香芹酮对照品保留时间处均未出现色谱峰，说明薄荷药材及处方中其他药材均无干扰，表明该方法专属性良好。

图1 气相色谱图：A.对照品溶液；B.薄荷对照药材溶液；C.留兰香对照药材溶液；D.阴性样品溶液；E.未检出香芹酮的样品溶液；F.检出香芹酮的样品溶液

1.3.3线性关系考察精密量取“1.2.2”项下制备的香芹酮对照品贮备溶液0.05、0.10、0.25、0.50、1.00、2.00 mL，分别用乙酸乙酯定容至10 mL，在“1.3.1”项规定的色谱条件下检测。以对照品峰面积为纵坐标（Y），其浓度为横坐标（X）建立标准曲线，结果线性回归方程为Y=3 893.4X-2 178.5，线性范围为1.07～42.82 μg/mL，相关系数r=0.999 2，表明线性关系良好。

1.3.4精密度试验取浓度为21.41 μg/mL 的香芹酮对照品溶液1μL，在“1.3.1”项规定的色谱条件下连续检测6 次，峰面积RSD 为0.93%（n=6），表明仪器精密度良好。

1.3.5稳定性试验以小儿感冒颗粒阳性样品的供试品溶液为实验对象，分别于供试品溶液制备后0、4、8、12、16、24 h 检测，结果香芹酮峰面积RSD 为1.12%（n=6），表明供试品溶液在24 h 内稳定。

1.3.6重复性试验称取小儿感冒颗粒阳性供试品6份，照“1.2.1”项下规定的步骤处理样品，在“1.3.1”项规定的色谱条件下检测，结果香芹酮峰面积RSD为1.35%（n=6），表明该方法重复性良好。

1.3.7加样回收率试验取已知香芹酮含量为12.16 μg/g 的小儿感冒颗粒阳性样品6 份，每份约3.5 g，精密称定，分别精密加入浓度为21.41 μg/mL的香芹酮对照品溶液1.60、2.00、2.40 mL 各3 份，再分别加乙酸乙酯使总体积为20.00 mL，照“1.2.1”项下方法处理样品，照“1.3.1”项下规定的色谱条件检测，计算回收率。结果见表2。

表2 回收率试验结果（n=9）

1.3.8检出限称取样品1 g，加入不同浓度的香芹酮对照品溶液适量，照“1.2.1”项下的步骤处理样品，照“1.3.1”项下的色谱条件检测，以信号噪声比为3 时1 g 样品中加入对照品的量作为检出限，最终测得检出限为1 μg/g（S/N=3）。

1.4 GC-MS/MS 联用法

1.4.1色谱条件色谱柱为DB-1701MS（30 m×0.32 mm，0.25 μm）；进样口温度200 ℃；传输线温度280 ℃；离子源温度300 ℃；柱温箱50 ℃保持1 min，再以5 ℃/min 升温至150 ℃，保持2 min，再以20 ℃/min升温至200 ℃保持5 min，进样量1 μL。SIM 模式；正离子方式扫描；薄荷脑特征离子为55、67、81、95、123、138，香芹酮特征离子为39、54、82、93、108。

1.4.2样品确证在GC 法供试品色谱图中，应不得出现与香芹酮对照品保留时间相同的色谱峰，如出现与香芹酮对照品保留时间相同的色谱峰，应采用GC-MS/MS 联用仪，按照“1.4.1”项下色谱条件进行进一步确证，其一级质谱不得与香芹酮对照品一致。

2 样品检测结果

取20 批小儿感冒颗粒样品，照“1.2.1”项下方法处理样品，按“1.3.1”项下规定的色谱条件测定香芹酮，结果GC 法检出与香芹酮对照品保留时间相同色谱峰的样品有3 批。经GC-MS/MS 确证，有2 批为阳性，香芹酮含量分别为2.13 μg/g 和12.16 μg/g。1 批经验证为假阳性，可能系原辅料中的其他杂质造成。由此说明，即使GC 法检出与香芹酮保留时间一致的色谱峰，仍需GC-MS/MS 进一步确证，以保证结果的准确性。

3 讨论

3.1 提取溶剂及提取时间的确定

曾对不同提取溶剂（甲醇、二氯甲烷、乙酸乙酯）和超声时间（10、20、30、40 min）进行考察，以香芹酮的提取率以及色谱图中杂质峰数量等为考察指标，发现乙酸乙酯提取率较高且杂质峰较少，超声时间20 min 之后香芹酮含量无明显增加，最终确定为采用乙酸乙酯超声20 min。

3.2 香芹酮限量的探讨

目前薄荷及含薄荷中成药检出香芹酮成分有相关文献报道［5-6］。本实验收集的20 批样品，2 批检出含香芹酮，占10%。但检出并不意味着不合格，因为根据《中国药典》2020 年版四部0212 药材和饮片检定通则的规定，饮片杂质通常应不得过3%。因此小儿感冒颗粒中含有多少香芹酮评定为不合格，尚需制定合理的限量值来进行判定。限量值的确定可以从供试品溶液制备时取样量、薄荷药材允许的杂质量、留兰香中香芹酮的平均含量等方面来考虑。本研究将会在后续的实验中对此进行更深入的探讨。