九头狮子草红色素基膜的制备及动态响应特征

谢微，邓忠惠，王仕敏

（贺州学院 a.食品与生物工程学院/食品科学与工程技术研究院 b.人工智能学院，广西 贺州 542899）

食品腐败是一个伴随着营养物质的分解和代谢物产生的复杂过程，不仅会造成食物浪费，而且会导致严重的食品安全问题[1]。富含蛋白质的食物发生腐败，会产生挥发性含氮化合物（如：氨气、二甲胺和三乙胺等），此时包装内部空间的pH 会增加[2]。发酵食品或乳制品的腐败及其代谢物会产生一些促使pH降低的气体[3]。传统的检测方法，如总挥发性碱性氮（TVB–N）、新鲜度指数（K值）、感官属性的评价等，复杂而耗时[4]。比色指示膜因其快速、相对廉价、无损性等特征[5]，在食品供应和销售的过程中监测包装内pH 的变化，进而间接得知包装食品的实时质量。包裹黑枸杞花色苷的木薯淀粉膜具有良好的pH 敏感性[6]。以明胶为基质的黑米糠花青素智能膜可有效地监测鱼类新鲜度[7]。利用天然花青素开发的包装膜在检测食品新鲜度方面很有效，但也存在一定的缺陷，如：热稳定性差、颜色不稳定、机械和阻隔性能难以满足食品包装的多样化需求。为了更好固定天然花青素，兼顾食品安全性，研究者将目标转向可生物降解天然材料。马蹄淀粉具有优异的胶凝特性和功能作用，是许多淀粉无法与之相比的[8]，但目前尚未发现其用于制备比色指示膜。

九头狮子草（Herba Peristrophe Japonica, HPJ），又名红蓝草，属于爵床科植物，主要分布在我国广西、福建、四川等地，是一种良好的天然食用色素来源[9]。研究表明，九头狮子草红色素具有较高的抗氧化活性和稳定性[10]，在美容保健、食品着色剂以及中药新药的开发等方面具有重要价值。但应用九头狮子草红色素制备比色指示膜的研究鲜有报道。

本研究从植物九头狮子草中提取红色素，以马蹄淀粉为成膜基材，丙三醇为增塑剂，采用溶液共混法制备一种基于九头狮子草红色素与马蹄淀粉相结合的比色指示膜，并研究其性质与动态响应特征。随着时间的增加，莴笋、猪肉、鱼肉等腐败加剧，比色指示膜的颜色变化呈现规律性的变化，较为直观且易于识别。

1 实验

1.1 材料与仪器

主要材料：九头狮子草购于广西蒙山县农贸市场；马蹄淀粉购于广西洲星食品有限公司；猪肉、鱼肉和莴笋购于贺州市八步区城西农贸市场。

主要仪器：UV–9000 紫外可见分光光度计，上海元析仪器有限公司；CR–400 色差计，柯尼卡美能达；CanoScan LiDe 300 高速照片扫描仪，佳能有限公司；DEGUQMNT 数显千分尺，上海美耐特实业有限公司；EV400 Touch 旋转蒸发仪，北京莱伯泰科仪器股份有限公司；SpectrumTwo 红外光谱仪，美国PerkinElmer 公司；JROL–7610F 扫描电子显微镜，日本电子株式会社等。

1.2 方法

1.2.1 九头狮子草红色素提取工艺

干燥的九头狮子草→粉碎→浸提→过滤→旋转蒸发→红色素浓缩液→冻干。九头狮子草和体积分数为70%的乙醇以固液比1 ∶3 混合后进行超声波处理（30 min、70 ℃、功率为50%），真空过滤取滤液。提取和过滤重复3 次。用旋转蒸发仪在65 ℃将滤液浓缩，冻干浓缩液即得九头狮子草红色素。

1.2.2 比色指示膜的制备

称取2 g 马蹄淀粉，溶于90 ℃的蒸馏水，加入2 mL 丙三醇搅拌30 min，得到混合溶液。当混合溶液冷却到50 ℃时，分别加入同体积质量分数为0%、2%、4%、6%、8%、10%的九头狮子草红色素浓缩液，搅拌15 min。使用超声清洗器超声25 min，即可得到成膜液。每25 mL 的成膜液倒入直径为90 mm 的洁净培养皿中，室温至凝固后，将培养皿放入电热恒温鼓风干燥箱中干燥，温度控制在65 ℃以内，8 h 后即可揭膜。

1.3 比色指示膜性质测定

1.3.1 比色指示膜的厚度测定

采用数显千分尺对比色指示膜进行随机采样，测试10 个采样点的厚度平均值作为膜的厚度。

1.3.2 比色指示膜的含水率测定

将质量为m1的比色指示膜放入105 ℃烘箱中干燥至质量不变，记为m2，每组平行测定3 次[11]，计算式见式（1）。

式中：Mc为比色指示膜的含水率；m1为膜质量恒定前的质量，g；m2为膜质量恒定后后的质量，g。

1.3.3 比色指示膜的水溶性测定

干燥至质量不变的比色指示膜，质量记为mi（g）；室温下将其浸泡于50 mL 蒸馏水中，24 h 后取出，比色指示膜放入105 ℃的烘箱中干燥至质量不变，质量为mf（g），每组平行测定3 次[11]。水溶性WS的计算式见式（2）

式中：mi为浸泡前的干燥恒质量；mf为浸泡后的干燥恒质量。

1.3.4 比色指示膜的颜色稳定性测定

将比色指示膜分别贮藏于4 ℃，相对湿度为75%的冰箱中，每天利用色差仪测定其色度值，按式（3）计算色差值表征颜色稳定性[12]。

式中：L、a、b分别为膜放置后的测定值；L0、a0、b0为膜放置前初始测定值。

1.3.5 比色指示膜的总花青素含量的测定

烧杯中加入0.8 g 膜和10 mL 酸化的乙醇（pH=1），均质1 min。过滤，溶液中加入酸化乙醇至10 mL，采用紫外可见分光光度计于520 nm 下读数[13]。

1.3.6 比色指示膜的总酚含量的测定

参考李楠等[14]的方法，分别添加1 mL 不同质量浓度的没食子酸（10、20、30、40、50 μg/mL）于5支试管中，各加入5.0 mL 福林酚，摇匀，静置5 min后再加入4 mL 质量浓度为0.075 mg/mL 的Na2CO3溶液，在温度为25 ℃的黑暗环境中反应30 min，以试剂空白为参比，765 nm 处测定吸光度，绘制总酚标准曲线。

25 ℃条件下，准确称取1.00 g 比色指示膜，加入100 mL 蒸馏水中浸提，抽滤得到比色指示膜提取液。将比色指示膜提取液替换没食子酸，其他试剂和步骤同标准曲线制作的方法，比色指示膜的总酚含量（mg/g）计算见式（4）。

式中：X为根据标准曲线查得的总酚含量，mg；V0为比色指示膜提取液的总体积，mL；V1为测定吸取的提取液体积，mL；m为样品质量，g。

1.3.7 比色指示膜的抗氧化性测定

参考刘晶等[15]的方法并稍作修改，测定膜的抗氧化性。比色指示膜样品加入100 μmol/L 的DPPH 甲醇水溶液中（V甲醇∶V水＝4 ∶1），配制比色指示膜当量为1 mg/mL的体系，在30 ℃的恒温条件下反应1 h，在517 nm 处测定其反应溶液的吸光度值。膜的DPPH自由基清除率计算式如（5）所示。

式中：A0为未添加膜的溶液吸光度值；A1为含膜反应液的吸光度值。

1.3.8 比色指示膜的灰度值测定

将装有比色指示膜的培养皿放置在高速照片扫描仪中扫描成像，然后利用Photoshop cs 6 测出其灰度值。

1.3.9 马蹄淀粉膜和比色指示膜的红外光谱测定

取马蹄淀粉膜和比色指示膜，用红外光谱仪在400～4 000 cm−1波数范围对薄膜进行红外光谱数据采集，并进行数据处理。

1.3.10 马蹄淀粉膜和比色指示膜的微观结构测定

使用扫描电子显微镜观察马蹄淀粉膜和比色指示膜的表面微观结构，并扫描拍照。

1.3.11 比色指示膜的三乙胺响应性测试

在曹乐乐[16]的研究基础上稍作修改，将比色指示膜裁剪成2 cm×2 cm 的正方形，用双面胶将其粘贴在透明盒的盖子内侧。透明盒中分别放入盛装MgCl2（或NaCl）饱和溶液的称量瓶，盖好盖子后放置 10 h，此时透明盒内的相对湿度分别为 33%和75%。另2 个称量瓶中分别加入5 mL 三乙胺并迅速放入透明盒底部，盖好盖子后观察并记录比色指示膜的颜色变化。

1.4 比色指示膜对猪肉、鱼肉和莴苣的应用

在25 ℃时，将处理干净的新鲜猪肉、鱼肉和莴笋切成大约1 cm3的小块，称取猪肉、鱼肉与莴笋各25 g 置于透明盒中。比色指示膜裁剪成2 cm×2 cm 的正方形，粘贴在透明盒盖子内侧，每个样品准备2 组。用高速照片扫描仪扫描成像，利用Photoshop cs 6 软件的取色器测定灰度值。

1.5 数据统计与分析

采用Origin2021、Microsoft Excel 进行数据处理，实验结果以平均值±标准差表示，利用方差分析进行显著性分析，以P＜0.05 确定。

2 结果与分析

2.1 比色指示膜的颜色测定

如图1 所示，从左往右是HPJH 的质量分数分别为0、2%、4%、6%、8%、10%的马蹄淀粉膜（即比色指示膜）图片。由图1 可知，添加同体积不同质量分数的HPJH 后，比色指示膜的颜色为红色，并逐渐变深。

图1 添加同体积不同质量分数HPJH 的比色指示膜Fig.1 Colorimetric indicator film with HPJH of different mass fractions but the same volume

2.2 比色指示膜的厚度

由图2 可以直观看出，比色指示膜的厚度随着同体积九头狮子草红色素溶液质量分数的增加而逐渐增大。由于比色指示膜中成膜基材马蹄淀粉和增塑剂丙三醇的用量是一定的，所以可以推断九头狮子草红色素的质量分数是影响比色指示膜厚度的主要因素。红色素质量分数的增大会引起成膜液中固形物含量的增多，从而增加比色指示膜厚度，这与文献报道是一致的[17]。同时，九头狮子草红色素的加入也会增加比色指示膜分子间距离，使比色指示膜的厚度增加。

图2 同体积不同质量分数HPJH 对比色指示膜厚度的影响Fig.2 Effect of HPJH of different mass fractions but the same volume on thickness of colorimetric indicator film

2.3 比色指示膜的含水率

如图3 所示，未添加九头狮子草红色素的比色指示膜含水率最高，其值为51.93%。添加九头狮子草红色素后，随着九头狮子草红色素含量的增加，比色指示膜的含水率呈上升的变化趋势。添加九头狮子草红色素使膜含水率下降的原因是九头狮子草红色素与马蹄淀粉之间存在相互作用，这种相互作用会破坏马蹄淀粉膜基质中的马蹄淀粉与马蹄淀粉之间的氢键，氢键作用越弱，水分附着能力越差，含水量就会下降。另外，九头狮子草红色素属于水溶性物质，九头狮子草红色素的质量分数越大其制备得的比色指示膜中的亲水性基团也就越多，因此比色指示膜的含水率也越高，这与文献[18]的观点一致。

图3 同体积不同质量分数HPJH 对比色指示膜含水率的影响Fig.3 Effect of HPJH of different mass fractions but the same volume on moisture content of colorimetric indicator film

2.4 比色指示膜的水溶性

水溶性是反映膜材料耐水性能的重要指标之一。由图4 可知，比色指示膜的水溶性随着同体积九头狮子草红色素质量分数的增大而逐渐增大。未添加九头狮子草红色素的比色指示膜水溶性为36.46%，而九头狮子草红色素质量分数为10%时水溶性达到最大，即为49.41%，这与未添加九头狮子草红色素的比色指示膜相比，添加后的水溶性增大了12.95%。加入九头狮子草红色素后，比色指示膜的水溶性明显上升，这是由于九头狮子草红色素是生物类黄酮组成的花青素，而花青素中含有较多的亲水性基团，其中的多酚类化合物与马蹄淀粉等成膜基质形成三维网状结构，削弱成膜基质中原本存在的分子间氢键作用力，增强与水的相互作用，这与文献[19]的结论一致。也有可能是过多的九头狮子草红色素会使比色指示膜的结构变得紊乱，降低高分子链之间的相互作用，增大比色指示膜中的溶解度，从而使比色指示膜的水溶性增大。

图4 同体积不同质量分数HPJH 对比色指示膜水溶性的影响Fig.4 Effect of HPJH of different mass fractions but the same volume on water solubility of colorimetric indicator film

2.5 比色指示膜的颜色稳定性

由图5 可知，含不同九头狮子草红色素质量分数的比色指示膜在4 ℃贮藏条件下，比色指示膜的颜色变化都不明显，均呈现出良好的颜色稳定性。当∆E<3.5 时颜色变化小，肉眼不可察觉[20]。因此，在4 ℃的贮藏条件下，添加了质量分数为8%的九头狮子草红色素浓缩液比色指示膜的稳定性最好，7 d 后的∆E值为1.649 7。这是由于加入的九头狮子草红色素与成膜基质之间存在相互作用，在一定程度上抑制了比色指示膜的红色素氧化[19]。

图5 同体积不同质量分数HPJH 对比色指示颜色稳定性的影响Fig.5 Effect of HPJH of different mass fractions but the same volume on color stability of colorimetric indicator film

2.6 比色指示膜的总花青素含量

由图6 可知，未添加九头狮子草红色素的比色指示膜在520 nm 处的吸光度仅为0.042 9，而随着红色素质量分数的逐渐增加，吸光度也逐渐增大，最终趋于平缓。这是因为九头狮子草红色素中含有花青素成分，九头狮子草红色素的质量分数越大，说明同体积下的花青素含量越高。由图6 可知，当九头狮子草红色素的质量分数增加至8%时，比色指示膜中的总花青素含量已达到平衡值。从质量分数为8%开始，总花青素含量趋于稳定状态。

图6 同体积不同质量分数HPJH 对比色指示膜总花青素含量的影响Fig.6 Effect of HPJH of different mass fractions but the same volume on total anthocyanin content of colorimetric indicator film

2.7 比色指示膜的总酚含量

由图7 可知，未添加九头狮子草红色素的比色指示膜总酚含量仅为23.357 1 mg/g。随着九头狮子草红色素质量分数的逐渐增加，比色指示膜的总酚含量也呈上升趋势。这主要是由于九头狮子草红色素含有酚类物质，而酚类物质存在组氨酸与酪氨酸等氨基酸残基，这些残基可以和福林酚试剂发生反应[21]。因此，随着九头狮子草红色素含量的增加，比色指示膜的总酚含量也会逐渐升高。

图7 同体积不同质量分数HPJH 对比色指示膜总酚含量的影响Fig.7 Effect of HPJH of different mass fractions but the same volume on total phenol content of colorimetric indicator film

2.8 比色指示膜的抗氧化性

由图8 可以看出，未添加红色素的比色指示膜（即马蹄淀粉膜）自由基清除率很低，仅为2.63%，这表明马蹄淀粉/丙三醇共混膜的抗氧化性能较差。九头狮子草红色素的添加可以显著提高比色指示膜的抗氧化性。当九头狮子草红色素质量分数为4%时，比色指示膜的DPPH 自由基清除率达到45.77%；当红色素质量分数为8%时，DPPH 自由基清除率达到最大，为88.70%。这充分表明九头狮子草红色素具有抗氧化作用，由于九头狮子草红色素属于类黄酮多酚物质，它所含有的芳环结构与酚羟基可以通过形成苯氧环来阻止自由基链式反应[22]。当九头狮子草红色素质量分数增加到8%时，膜的DPPH 自由基清除率就会逐渐趋于平缓，这主要是因为当九头狮子草红色素含量过大时，多余的红色素就会在比色指示膜的表面形成颗粒状，而酚羟基就会逐渐被空气中氧气所消耗，所以比色指示膜的DPPH 自由基清除率逐渐趋于平缓。由此可知，九头狮子草基膜不仅可以作为比色指示膜使用，还可以应用在食品的抗氧化功能方面，减缓食品的氧化变质速度。

图8 同体积不同质量分数HPJH 对比色指示膜抗氧化性的影响Fig.8 Effect of HPJH of different mass fractions but the same volume on oxidation resistance of colorimetric indicator film

2.9 比色指示膜的灰度值分析

共混均匀性是评价可降解型比色指示膜性能的重要影响因素之一。由图9 可知，未添加九头狮子草红色素的灰度值仅为48.5%，而随着九头狮子草红色素质量分数的逐渐增加，比色指示膜的灰度值也逐渐增大，然后趋于平缓。当九头狮子草红色素质量分数达到10%时，灰度值为78.25%。这可能是因为添加九头狮子草红色素后，可使复合材料的界面相容性变好，比色指示膜混合液也较为均匀。

图9 同体积不同质量分数HPJH 比色指示膜对灰度值的影响Fig.9 Effect of HPJH of different mass fractions but the same volume on gray value of colorimetric indicator film

2.10 红外光谱分析

马蹄淀粉膜和比色指示膜的红外光谱见图10。由图10 可知，马蹄淀粉膜的红外光谱图表现出马蹄淀粉的特征谱带。3 200 cm−1附近有一个极大强度的吸收峰，是羟基O−H 的特征吸收峰；2 930 cm−1处是一个中小强度的吸收峰，是属于CH2的伸缩振动；1 640 cm−1附近的吸收峰归属于水分子中的H−O−H的伸缩振动；1 415 cm−1附近的吸收峰归属CH2变形振动，850 cm−1附近的吸收峰峰可归属于CH2摇摆吸收峰[23]。马蹄淀粉膜和比色指示膜的红外光谱非常相似，九头狮子草红色素的加入对马蹄淀粉膜的红外光谱没有明显的影响，这可能是比色指示膜的九头狮子草红色素的含量较低。与马蹄淀粉膜相比，比色指示膜的O−H 伸缩振动（从3 267 cm−1到3 272cm−1）有轻微的谱带位移。说明九头狮子草红色素与马蹄淀粉膜中的其他组分之间可能形成了氢键相互作用[24]。

图10 马蹄淀粉膜和比色指示膜红外光谱图Fig.10 FTIR spectra of water chestnut starch film and colorimetric indicator film

2.11 微观形貌分析

马蹄淀粉膜与比色指示膜在放大倍数为1 000 的条件下所拍摄的SEM 图见图11。马蹄淀粉膜和比色指示膜的表面连续且致密，无孔洞。但是，比色指示膜的表面结构更加致密，说明马蹄淀粉与丙三醇和九头狮子草红色素的相容性较好，九头狮子草红色素对马蹄淀粉有很强的适应性，对马蹄淀粉膜材料的结构影响不大[25]。

图11 马蹄淀粉膜和比色指示膜的SEM 照片Fig.11 SEM photos of water chestnut starch film and colorimetric indicator film

2.12 比色指示膜对三乙胺响应性结果分析

比色指示膜在不同相对湿度（33%和75%）环境下灰度值的实时变化见图12。比色指示膜对三乙胺响应过程中灰度值随着响应时间的延长先增大然后趋于平缓。在同一响应时间、不同相对湿度环境条件下，灰度值也会不相同，并且灰度值会随湿度的增加而逐渐增大，这说明湿度越大，比色指示膜对三乙胺的响应性越好。在响应过程中，比色指示膜的颜色发生显著的变化，由红色变成橘黄色。其响应机理是在一定的湿度环境下，三乙胺会与比色指示膜表面上的水分子结合并形成OH−和N+(C2H5)3[16]。

图12 不同相对湿度环境下比色指示膜灰度值的变化Fig.12 Gray value of colorimetric indicator film under different relative humidity

2.13 比色指示膜在监测猪肉、鱼肉和莴笋新鲜度时灰度值与颜色的变化

从表1 可以看出，猪肉、鱼肉和莴笋在0、36、48 h 内，实物的颜色随着新鲜度的变化而变化。在实验过程中，猪肉一开始表面略微干，呈鲜红色，正常气味；36 h 后猪肉颜色变暗，黏液污浊，能感知到轻微异味；48 h 后猪肉颜色发灰，出现恶臭气息。鱼肉在实验初始时色泽洁白，且外表湿润，气味正常；36 h 后鱼肉的色泽为灰色，外表黏腻，异味明显；48 h 后鱼肉的颜色为褐色，具有浓烈的腐败味。莴笋在实验初始时十分新鲜，外表为绿色，无腐烂的情况；36 h 后莴笋表面出现肉眼可见的褐变，稍有腐烂气味；48 h 后莴苣整体褐变十分严重，腐烂十分严重。

表1 比色指示膜对猪肉、鱼肉和莴笋的颜色动态响应Tab.1 Color dynamic response of colorimetric indicator film to pork, fish and lettuce

从表1 还可以看出，比色指示膜在0、12、24、36、48 h 内也呈现明显的颜色变化。猪肉比色指示膜最初表现为红色，12 h 后变为淡红色，24 h 后变为橘黄色，鱼肉和莴笋的比色指示膜颜色变化也是由红色→淡红色→橘黄色的趋势变化。同时，从图13 中可以看出，随着猪肉、鱼肉和莴笋的放置时间越长，比色指示膜的灰度值也呈现逐渐减小趋势，这与实物随时间的变化图相一致。表明比色指示膜能够实时监测猪肉、鱼肉和莴笋的新鲜度。

图13 比色指示膜监测不同样品的灰度值变化趋势Fig.13 Gray value of different samples monitored by colorimetric indicator film

3 结语

本研究发现九头狮子草红色素可提高马蹄淀粉膜的指示效果。九头狮子草红色素–丙三醇–马蹄淀粉指示膜（即比色指示膜）比单一的马蹄淀粉膜厚度大、抗氧化性强、总酚含量高、色差大。比色指示膜对三乙胺具有响应性，适合用于食品新鲜度的指示。当添加质量分数为8%的九头狮子草红色素制得的比色指示膜用于监测猪肉、鱼肉和莴笋的新鲜度时，发现指示膜在猪肉、鱼肉和莴笋的腐败过程中都表现出明显的颜色变化，与实物随时间的变化图相一致。表明比色指示膜能够实时监测猪肉、鱼肉和莴笋的新鲜度。