基于柱前Hantzsch 衍生高效液相色谱法检测纸吸管中微量游离甲醛

◎ 陈 闯，肖 宇，李永丽，薛 康

（成都海关技术中心，四川 成都 610041）

甲醛无色具有刺激性气味，影响机体的免疫系统，能对人体造成包括嗅觉、肺功能、免疫功能、肝功能的异常及损伤，还可能诱发细胞基因突变，具有一定的遗传毒性[1]。2017 年世界卫生组织国际癌症研究机构公布甲醛在Ⅰ类致癌物列表清单中。2022 年我国发布《食品安全国家标准 食品接触纸和纸板材料及制品》（GB 4806.8—2022）国家标准，规定甲醛残留量应≤1 mg·dm-2[2]。甲醛作为化工原料也常应用于食品接触材料中，其单体及其低聚物会残留在这些食品接触材料中，食品接触用纸制品使用到的原材料、助剂、胶粘剂等以及不法企业使用的废纸原料，均有可能引入甲醛[3-5]。

目前针对纸质食品接触材料中甲醛的检测主要是使用分光光度法[6-7]和基于2,4-二硝基苯肼衍生的高效液相色谱法[8-10]。分光光度法易受食品接触用纸及纸制品在水提取过程中褪色的影响，引起吸光度测量误差，造成测量不准确[11-12]。2,4-二硝基苯肼几乎能与所有酮、醛发生衍生反应，反应产物较复杂，同样纸制品中也可能含有其他醛酮类物质，易产生干扰[13-14]。由于乙酰丙酮只与甲醛和乙醛发生Hantzsch衍生反应，且在高效液相色谱条件下易分离出两者的衍生产物，产生的甲醛衍生产物为2,6-二甲基-3,5-二乙酰基-1,4-二氢吡啶，在可见光区有最大吸收波长为415 nm，可通过液相色谱仪进行检测[15-16]。徐莉莉等[17]、曾文祥等[18]、王晨蕾等[19]已成功应用上述衍生反应结合液相色谱法对酒类及牙膏中微量甲醛进行了检测。

本文利用乙酰丙酮与甲醛发生Hantzsch 衍生的反应产物特性，参考相关标准文献，借助高效液相色谱仪，旨在建立一种操作简便、定量准确、精密度高，适用于纸吸管中微量游离甲醛含量测定的检测方法。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

网络及线下市场随机购买的不同品牌纸吸管样品各8 批次，密封保存，冷藏备用。

甲醛标准品（北京曼哈格生物科技有限公司，100 mg·L-1）；乙酰丙酮（天津科密欧化学试剂有限公司）；乙酸、乙酸铵、乙腈（美国天地化学试剂有限公司，色谱纯）。

安捷伦1200 高效液相色谱仪带二极管阵列检测器（美国安捷伦科技公司）；恒温水浴锅（浙江金坛富华仪器有限公司）；VORTEX GENIUS 3 涡旋混匀仪（德国IKA 公司）； XS 105 Dual Range 电子天平（瑞士梅特勒-托利公司）；MIMI-Q A10 超纯水仪（美国密理博公司）；0.45 μm 水相滤膜（津腾公司）。

1.2 实验方法

1.2.1 溶液配制

2%乙酰丙酮衍生液配制：称取150 g 乙酸铵至500 mL 容量瓶中，加入7.5 mL 乙酸及1.00 g 乙酰丙酮，超纯水溶解后并定容至500 mL，放置于2 ～8 ℃冰箱避光保存。

10 mg·L-1甲醛标准中间液：吸取100 mg·L-1甲醛标准1 mL 至10 mL 容量瓶中，加超纯水定容。

1.2.2 甲醛衍生物标准系列溶液配制

分别吸取10 mg·L-1甲醛标准中间液0 μL、50 μL、100 μL、200 μL、400 μL、800 μL、1 600 μL 和3 200 μL至10 mL 具塞比色管中，然后各加入2%乙酰丙酮衍生液2.5 mL，超纯水定容至刻度，玻璃塞密封比色管，涡旋混匀，放置于恒温水浴锅，在60 ℃条件下水浴15 min 后冷却，即配制成浓度为0 mg·L-1、0.05 mg·L-1、0.10 mg·L-1、0.20 mg·L-1、0.40 mg·L-1、0.80 mg·L-1、1.60 mg·L-1和3.20 mg·L-1甲醛衍生物标准溶液（现配现用）。

1.2.3 样品前处理

考虑到纸吸管在使用过程中预期温度可能超过40 ℃，参考食品安全国家标准GB 4806.8—2022 中关于对食品接触用纸和纸板材料及制品测定甲醛时制取水提取试液的规定。称取剪碎至1 cm2大小的纸吸管样品10 g左右（精确至0.01 g），将样品置于具塞250 mL三角烧瓶中，加入200 mL 沸水，盖上塞子。将烧瓶置于恒温水浴槽中，控制温度为（80±2）℃，时间为（120±5）min，其间不时振摇。时间到后，将溶液从烧瓶中转移至250 mL 容量瓶中，并用80 ℃的水冲洗试样2 次，洗涤液并入250 mL 容量瓶中，冷却至20℃定容混匀。吸取提取液5 mL 至10 mL 具塞比色管中，同理按照1.2.2 方式衍生处理，反应结束，取提取液过0.45 μm 水相滤膜至进样瓶中供液相色谱检测。按同样方法制备空白溶液。

1.2.4 液相色谱条件

色谱柱：SHIMADZU VP-ODS C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：水∶乙腈=80 ∶20；流速：1.0 mL·min-1；检测波长：415 nm；进样量：10 μL；柱温：30 ℃。

2 结果与分析

2.1 检测波长的确定

通过安捷伦液相色谱二极管阵列检测器进行3D光谱扫描，发现甲醛衍生产物在254 nm 和415 nm 处分别都有吸收峰。对比发现虽然在254 nm 响应值较高，但在该紫外波段附近的其他杂峰较多，甲醛衍生物检测易受干扰，因此选择415 nm 作为检测波长。

2.2 衍生温度与时间优化

根据GB 31604.48—2016 食品接触材料及制品甲醛迁移量的测定中分光光度法衍生条件，该衍生反应在40 ℃水浴中放置30 min 即可反应完全[20]。

将3.2 mg·L-1的甲醛溶液按1.2.2 实验方法考察反应温度为40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃对衍生反应后甲醛衍生产物在液相色谱仪上的衍生峰响应面积的影响。设置反应时间为5 min、10 min、15 min、20 min、30 min、60 min，发现实验前期在相同的时间内，衍生温度越高，衍生峰面积越大（图1）。在10 min后60 ℃、70 ℃、80 ℃的条件下，衍生峰面积趋于最大并基本稳定，最大面积与在40 ℃水浴中放置30 min时衍生峰面积基本一致。为确保反应完全同时考虑时效性，选定衍生温度为60 ℃，时间为15 min。

图1 衍生温度和时间对衍生峰面积的影响图

2.3 衍生剂浓度对衍生峰面积的影响

配制3.2 mg·L-1的甲醛溶液，加入浓度为0%、0.1%、0.2%、0.4%、1.0%、1.5%、2.0%、4.0% 和5.0% 的乙酰丙酮衍生液2.5 mL，按照1.2.2 方式衍生处理，冷却后检测，考察加入乙酰丙酮浓度对衍生峰面积的影响，结果见表1。结果表明，随着乙酰丙酮衍生液浓度的增大，衍生物峰面积逐渐增大；当加入的乙酰丙酮浓度在1.5%以上时，衍生峰面积就基本趋于保持恒定。该实验选择加入浓度为2%的乙酰丙酮衍生液。

表1 乙酰丙酮衍生液浓度对衍生峰面积的影响表

2.4 方法学考察

2.4.1 方法专属性

通过液相色谱仪器检测甲醛衍生物标准系列，甲醛衍生物的保留时间为9.19 min。对比空白标准衍生液与甲醛衍生物标准浓度为0.1 mg·L-1的色谱图，结果显示在衍生物出峰位置及附近未出现其他干扰峰，该方法的专属性较好，详见图2、图3。

图2 空白标准衍生液图

图3 0.1 mg·L-1 甲醛衍生物标准图

2.4.2 方法检出限与定量限

取6 份10 g 阴性纸吸管样品，按1.2.3 制备6 份甲醛加标浓度为0.01 mg·L-1、0.02 mg·L-1、0.05 mg·L-1、0.10 mg·L-1、0.20 mg·L-1和0.50 mg·L-1的甲醛衍生物上机溶液，通过液相色谱检测。拟将待测物的信噪比约为3 ∶1 时，对应的加标浓度定为仪器检出限；将信噪比约为10 ∶1 时，对应的加标浓度定为仪器定量限。

实验结果显示在0.02 mg·L-1浓度时测的信噪比为4.3；在0.05 mg·L-1浓度时测的信噪比为12.6，综合色谱图基线情况选取0.02 mg·L-1为仪器的检出限，0.05 mg·L-1为仪器的定量限。根据样品前处理及稀释比例，对应的该方法的检出限及定量限分别为1.0 mg·kg-1和2.5 mg·kg-1。

2.4.3 标准曲线

配制浓度为0 mg·L-1、0.05 mg·L-1、0.10 mg·L-1、0.20 mg·L-1、0.40 mg·L-1、0.80 mg·L-1、1.60 mg·L-1和3.20 mg·L-1的甲醛衍生物标准系列溶液，通过液相色谱仪检测，以浓度为横坐标，衍生峰面积为纵坐标绘制标准曲线。甲醛衍生物标准在0.05 ～3.20 mg·L-1与之对应衍生物峰面积呈线性，线性方程为y=120.61x-0.094，相关系数R2为0.999 8。说明甲醛衍生物上机浓度在0.05 ～3.20 mg·L-1时与甲醛衍生物峰面积之间有较好的线性关系。

2.4.4 方法回收率和精密度

取某阳性样品按照1.2.3 衍生反应处理，进行6 次检测，样品提取液本底平均值为1.87 mg·L-1。同理该样品分别按照1 倍定量限、10 倍定量限和40 倍定量限，做3 个浓度的加标衍生反应，最终折算为上机溶液中加标浓度为0.05 mg·L-1、0.50 mg·L-1、2.00 mg·L-1，分别进行6 次测定。3 种不同添加浓度下的加标回收率为87.2%～106.1%，RSD 为1.42%～4.63%。方法具有良好的回收率及精密度，满足检测方法对加标回收率及精密度的要求。相关数据及结果见表2。

表2 甲醛加标回收率和精密度结果表（n=6）

2.5 实际样品的检测

在网络及线下市场随机购买不同品牌的纸吸管样品各8 份，共16 份样品，称取重量、量取尺寸，对残留的游离甲醛含量进行检测，并按照面积折算检测结果。其中有4 份纸吸管浸泡液甲醛检测结果呈阳性，按面积折算结果值均小于1 mg·dm-2，符合《食品安全国家标准 食品接触用纸和纸板材料及制品》（GB 4806.8—2022）中甲醛残留量要求。由于本次所检样品不能代表所有纸吸管产品的结果，而且纸吸管是直接与口腔接触的食品接触材料，较低的含量也应该引起消费者企业，相关监管部门的注意。各数据结果见表3。

表3 纸吸管样品的测定表

3 结论

本文确定以添加浓度为2%乙酰丙酮衍生液与甲醛在60 ℃、15 min 的条件下完成Hantzsch 衍生反应，利用生成的甲醛衍生物在可见光区有最大吸收波长415 nm，经高效液相色谱分离并检测甲醛衍生物，外标法定量，建立了针对检测纸吸管中微量游离甲醛的基于柱前Hantzsch 衍生高效液相色谱法。该方法操作简便、选择性好、定量准确、回收率及精密度良好，可以满足对纸吸管中残留的微量游离甲醛的定性、定量检测分析。