反相HPLC 快速测定全反式维生素A 含量的方法探究

◎ 温恺嘉，王小妹，林元亨，许文东，韩亚明，袁 诚，梁北梅，黄晓玲，武林贺，卢嘉颉

（1.广州白云山汉方现代药业有限公司，广东 广州 510240；2.中药制药过程技术与新药创制国家工程研究中心，广东 广州 510240；3.广东省药用脂质重点实验室，广东 广州 510240）

维生素A（视黄醇）是一种脂溶性的维生素，具有多种生理功能，其对视网膜、皮肤组织及人体骨骼发育、男性精子的形成和胎儿生长发育、改善贫血以及提高免疫力等方面具有良好的作用，因此被广泛应用到各种配方食品中[1-4]。维生素A 的性质不稳定[5]，不利于存放或加工，所以市售的维生素A 原料多数以醋酸酯或棕榈酸酯形式存在，因其稳定性较佳，被广泛应用到含维生素A 的特殊食品加工中。维生素A 棕榈酸酯主要通过复杂的反应与合成过程制得，以反式结构为主，同时伴随少量的顺式结构，但具有活性的仅有反式结构[6]，顺式异构体不具有活性，这表明只有准确测定出样品的全部反式维生素A 含量，才能准确表达维生素A 的含量。

目前，市售的维生素A 棕榈酸酯原料主要以全反式构型存在，因生产反应条件苛刻，生产过程会产生少量顺式异构体，这导致含维生素A 的成品均不可避免地含有少量顺式异构体。

目前，关于全反式维生素A 及其顺式异构体检测的相关文献较少，研究者利用正相色谱系统分离维生素A 的顺反异构体[7-10]。采用反相液相色谱（Reversed Phase High Performance Liquid Chromatography，RP-HPLC）测定的标准如GB 5009.82—2016[11]中规定的色谱条件，其维生素A 的顺、反异构体的分离度低，无法达到基线分离，且该方法中样品前处理是经过水解、皂化、萃取、分离、回收、定容等步骤制得游离态的维生素A 再进行测定，其操作步骤多且烦琐，耗时长且准确度差。本文以含维生素A 棕榈酸酯的维生素预混料与全营养乳为研究对象，针对现有的全反式维生素A 测定缺陷，通过对样品前处理及色谱条件的反复探索、测试、确认，建立了反式维生素A 含量测定的方法，该方法简单、精密度高、准确度好。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

全营养乳，广州白云山汉方现代药业有限公司实验室自制；维生素预混料（含维生素A 棕榈酸酯的原料）；乙腈、异丙醇，色谱纯，Sigma 公司；正己烷、无水乙醇，分析纯，广东光华科技股份有限公司；维生素A 棕榈酸酯对照品，Sigma 公司，批号为MKCM3866。

1.2 仪器与设备

高效液相色谱仪（Thermo U3000），美国赛默飞公司；电子天平，日本岛津公司，AP225WD；振荡器，美国艾卡公司，VIBRAX-VXR。

1.3 方法

1.3.1 样品溶液的制备

液体样品精密称取10 g，置于100 mL 的具塞试管中；固体样品精密称取0.5 ～2.0 g，并加入纯水10 mL使固体溶解，置于100 mL 的具塞试管中。精密加入正己烷20.0 mL，塞上塞子，置于振荡器上，以2 000 r·min-1振荡处理6 min，振荡完毕加入无水乙醇20 mL，再次以2 000 r·min-1处理2 min，开塞释放气体后再盖上塞子，静置直到溶液分层，精密吸取上清液5.0 mL，40 ℃氮吹至干，以2.0 mL 异丙醇复溶残渣，过滤，即得。

1.3.2 对照品储备液

称取维生素A 棕榈酸酯对照品50 mg，加入5 mL正戊烷溶解固体后，以异丙醇稀释至50 mL，得浓度约为1 mg·mL-1（1 810 IU·mL-1）的对照品储备液，按要求标定其含量。

1.3.3 对照品的标定

（1）对照品标定液制备。精密吸取对照品储备液0.8 mL，以异丙醇稀释至100 mL，得浓度为8 μg·mL-1（14.5 IU·mL-1）的对照品标定液[12]。

（2）测定。取标准品校正液适量，采用紫外分光光度法，在200 ～400 nm 处扫描，确定标准液的最大吸收峰在326 nm 附近。若测定值符合规定，则再次测定校正液分别在300 nm、326 nm、350 nm以及370 nm的吸光度值，分别计算另外3 个不同波长下的吸光度与326 nm 处吸光度之比，见表1。

表1 不同波长的吸光度比值表

若上述标定有一项不符合规定，则应更换另外批号的标准品，重新进行校正，符合要求的，依据公式（1）计算标准品中维生素A 棕榈酸酯含量，维生素A 棕榈酸酯国际单位1 IU=0.550 μg。

式中：ω1为维生素A 棕榈酸酯含量，μg·g-1；A326为标准品校正液在326 nm 处的吸光度；1 900 为维生素A 棕榈酸酯吸光度与含量（IU）的换算系数；V为溶液的稀释倍数；m为对照品的质量，g；100 为换算系数。

1.3.4 标准曲线溶液

精密吸取对照品储备液，利用异丙醇稀释2 倍，利用标定的含量计算其溶液浓度，得浓度约为10 µg·mL-1的对照品中间液。取该溶液，再以异丙醇依次稀释，得标准曲线溶液1 ～5，该标准曲线溶液中含维A 棕榈酸酯的浓度依次为0.4 μg·mL-1、1.0 μg·mL-1、2.0 μg·mL-1、4.0 μg·mL-1和10.0 μg·mL-1。

1.4 色谱条件

色谱柱：安捷伦HC-C18（2）（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈-异丙醇（95 ∶5）；运行时间：50 min；流速：2.0 mL·min-1；柱温：27 ℃；检测波长：325 nm；进样量：20 μL。

1.5 测定与计算

按色谱条件依次进样，记录色谱图，根据标准曲线求得样品溶液含维生素A 棕榈酸酯的浓度，并根据保留时间进行定性，按公式（2）求出反式维生素A的含量。

式中：X为样品中反式维生素A（以视黄醇计）的含量，μg/100 g；ρ为样品溶液中反式维生素A 棕榈酸酯的浓度，μg·mL-1；V为样品溶液的稀释倍数；m为试样质量，g；100 为换算系数；0.545 8 为转换因子（维生素A 与维生素A 棕榈酸酯分子量的比值）。

2 结果与分析

2.1 正相色谱与反相色谱法的选择

高效液相色谱法中，正相色谱使用的常用固定相为硅胶与氰基键合硅胶等极性的化学键合固定相，使用过程易受污染，根据其特性，不宜使用含水的高极性溶剂冲洗，导致使用寿命短，检测成本高，不利于推广应用[13]。反相液相色谱流动相采用极性或中等极性溶剂，对仪器与色谱柱性能要求相对较低，在实验室的应用更广。

2.2 提取溶剂及使用量的考察

正己烷与乙醇能在一定比例下互相溶解，不利于目标物转移至正己烷层，因此需考察二者比例。称取全营养乳样品约10 g，置于100 mL 具塞试管里，精密量取并加入正己烷20 mL，利用振荡器以2 000 r·min-1条件处理6 min，平行制备3 份。3 份样品分别加入无水乙醇10 mL、15 mL、20 mL，其余操作与“1.3.1”项所述一致。根据实验现象，无水乙醇为10 mL 添加量时，样品溶液呈乳化状无法分层；为15 mL 添加量时，样品溶液分层时间大于20 min；为20 mL 添加量时，样品溶液分层时间约为10 min。由此得出，当正己烷-无水乙醇添加量的比例为1∶1时，样品分层效果最好。

2.3 色谱条件的选择

通过多组实验比较，得出乙腈-异丙醇系统较适合用于维生素A 棕榈酸酯及其异构体的分离，具体研究的流动相色谱条件见表2。当乙腈的比例≥95%时，与异构体峰分离度大于1.5，两个异构体峰能实现基线分离，取主峰保留时间与分离度两者作为选择条件，条件2 为最佳条件。

表2 流动相比例考察结果表

2.4 C18 色谱柱的选择

按“1.4 项”色谱条件所述，笔者随机取7 款市售C18柱对样品的系统适用性进行考察，具体见表3。

表3 色谱柱考察结果表

序号3 的安捷伦HC-C18色谱柱适用于维生素A 棕榈酸酯及其异构体的分离，分离度最优。而GB 5009.82—2016分离全反式维生素A 及其异构体无法分离，具体见图1。

图1 国标法测定维生素A 图谱

2.5 系统适用性与专属性试验

按照“1.3.1 项”所述的方法，取全营养乳、维生素A 棕榈酸酯原料分别制备全营养乳样品溶液、维生素预混料样品溶液；按刘华英[14]所述，取全反式维生素A 棕榈酸酯储备液，加入碘-乙醇液（2 mg·L-1），混匀，置日光灯下30 min 以上，即得到维生素A 棕榈酸酯异构体转化溶液。精密吸取异丙醇与上述溶液各20 μL，根据“1.4 项”所述色谱条件进样，考察样品溶液的专属性，测定结果如图2 所示，表明在该条件下，异丙醇对主峰测定无干扰，顺、反式维生素A 棕榈酸酯主峰基线分离，对照液与样品溶液主峰保留时间一致。

图2 系统适用性试验图谱

2.6 线性关系考察

按“1.3.2、1.3.3、1.3.4 项”所述制备维生素A棕榈酸酯标准曲线溶液，按拟定条件进样，每一份浓度的溶液连续进样3 次，以维生素A 棕榈酸酯浓度（μg·mL-1）作X轴，峰面积取均值后作Y轴，得标准曲线为Y=0.736 6X-0.044 8，R2为1.000 0，表明在反式维生素A 棕榈酸酯浓度为0.4 ～10.0 μg·mL-1时，方法线性良好。

2.7 精密度试验

取全营养乳样品，依据“1.3.1 项”所述方法处理样品，进行精密度试验，包括重复性与中间精密度。其中重复性结果以反式维生素A 计，为69.33 μg/100 g（n=6），RSD 为1.5%；中间精密度结果以反式维生素A 计，为66.04 μg/100 g（n=6），RSD 为1.5%。12 份样品的反式维生素A 平均值为67.69 μg/100 g（n=12），RSD 为3.1%，结果表明方法的精密度良好。

取维生素预混料（含维生素A 棕榈酸酯的原料）样品，按“1.3.1 项”所述方法处理样品，进行精密度试验，包括重复性与中间精密度。其中重复性结果以反式维生素A 计，为85.04 mg /100g（n=6），RSD 为1.8%；中间精密度结果以反式维生素A 计，为86.71 mg/100 g（n=6），RSD 为1.3%。12 份样品的反式维生素A 平均值为85.86 mg/100g（n=12），RSD 为2.5%，结果表明方法的精密度良好。

2.8 准确度试验

取全营养乳样品、维生素预混料（含维生素A 棕榈酸酯的原料），分别进行维生素A 棕榈酸酯加标回收试验，具体结果见表4。全营养乳样品在80%、100%、120%的平均回收率依次为103.5%、106.6%、105.0%，其相对标准偏差分别为1.6%、1.8%、2.0%；维生素预混料样品在80%、100%、120%的平均回收率依次为100.2%、100.6%、99.2%，其相对标准偏差分别为1.5%、0.9%、0.4%，二者RSD 均小于3%，符合测定的准确度要求。

表4 加样回收试验数据表

2.9 溶液稳定性试验

取全营养乳样品与维生素预混料样品，依据“1.3.1项”所述分别制得样品溶液1 份，在0 h、4 h、8 h、12 h、18 h、24 h 的时间点上，将该溶液在按照“1.4 项”所述的色谱条件下，重复进样，其峰面积RSD分别为0.4%与0.8%，实验结果表明该样品溶液在24 h 内稳定。

2.10 耐用性试验

通过改变色谱条件单因素条件（如不同柱温、流速、流动相比例，以及选用同一类型但不同批号的色谱柱共7 个条件），分别对全营养乳样品与维生素预混料样品进行含量测定。比较原始条件及经过微小改变的7 个单因素色谱条件的测定结果，其RSD 均小于3%。表明当色谱条件微小变动，对反式维生素A 测定结果的影响不大。

2.11 含量测定

取10 批广州白云山汉方现代药业有限公司实验室自制的全营养乳样品、2 批市售的特医食品以及3 批维生素预混料，按上文所述条件分别操作，测定样品中全反式维生素A 的含量，具体结果见表5。

表5 反式维生素A 含量测定结果表

3 结论

本文针对目前技术对食品中的全反式维生素A 测定存在的测定步骤多、前处理耗时长、准确性低且色谱分离效果不佳等问题，建立了一种反相高效液相色谱法测定全反式维生素A 含量的方法。分别对样品制备的溶剂、提取的手段以及色谱条件进行反复探索、测试，并通过一系列的线性、精密度、准确度、稳定性与耐用性的考察，使目标成分与其他组分能较好分离，测得结果准确可靠。在小试工艺或配方筛选时，可作为分析全反式维生素A 的快速检验手段，对各类产品中反式维生素A 含量的测定具有指导性作用。