食用农产品中四环素类药物的检测方法对比

◎ 李 龙

（龙口市检验检测中心，山东 龙口 265701）

四环素类药物是一种对多数革兰氏阳性及阴性细菌、衣原体、支原体、原生动物寄生虫等具有良好抑制作用的广谱抗生素[1]。在动物养殖过程中常用来预防和治疗细菌感染性疾病，但长期使用、滥用会导致四环素类药物在动物体内蓄积，继而引发动物源性食品中的药物残留问题。长期食用四环素类药物残留的动物性食品可引起人类的慢性毒性、身体耐药性的增加[2]，故四环素类药物残留量的检测成为每年食用农产品中监督抽检的重点项目。日常监督抽检的四环素类项目主要为金霉素、土霉素、四环素、多西环素4 种。涉及的检测标准为《食品安全国家标准 动物性食品中四环素类、磺胺类和喹诺酮类药物残留量的测定 液相色谱-串联质谱法》（GB 31658.17—2021）[3]、《动物源性食品中四环素类兽药残留量检测方法 液相色谱-质谱/质谱法与高效液相色谱法》（GB/T 21317—2007）[4]、《食品安全国家标准 水产品中土霉素、四环素、金霉素和多西环素残留量的测定》（GB 31656.11—2021）[5]、《食品安全国家标准禽蛋、奶和奶粉中多西环素残留量的测定 液相色谱-串联质谱法》（GB 31659.2—2022）[6]。本文从多个方面对4 个国家标准进行详细比较分析，为日常监督抽检工作中的方法选择适用性、检验数据、判定依据准确性提供一定的参考。

1 标准适用范围的比较分析

按照《食品安全监督抽检实施细则》（2023 年版）中的食品分类，食用农产品为第三十三食品大类，涉及四环素类药物残留量检测的食品亚类包括畜禽肉及副产品、水产品、鲜蛋。四环素类药物残留量的4 个检测标准中，GB 31658.17—2021（以下简称GB 31658.17）标准适用范围为牛、羊、猪和鸡的肌肉、肝脏和肾脏组织中四环素类药物残留量的检测，对应抽检实施细则中的食品细类为猪肉、牛肉、羊肉、鸡肉、猪肝、猪肾。GB/T 21317—2007（以下简称GB/T 21317）标准的适用范围为动物肌肉、内脏组织、水产品、牛奶等动物源食品中四环素类药物残留量的检测，在监督抽检中适用于鸭肉、其他禽肉的检测。GB 31656.11—2021（以下简称GB 31656.11）标准适用于鱼、虾、蟹、鳖及海参等水产品可食组织中4 种四环素类物质的测定，2023 版的抽检实施细则只涉及淡水虾、海水虾的食品细类。GB 31659.2—2022（以下简称GB 31659.2）标准适用于鸡蛋、鸭蛋、鹅蛋、牛奶粉、羊奶粉、牛奶和羊奶中多西环素残留量的测定，对应的食品细类为鸡蛋、其他禽蛋（限鸭蛋、鹅蛋），且只在生产日期2023 年2 月1 日后的产品中检测多西环素药物残留量。

综上分析，GB 31658.17 为2022 年2 月1 日实施的能同时检测动物性食品中四环素类、磺胺类和喹诺酮类药物残留量的液相色谱-串联质谱法，但是标准适用的动物种类只有牛、羊、猪、鸡，靶组织包括肌肉、肝脏、肾脏，其余种类不适用，故鸭肉、其他禽肉产品中四环素类药物的测定可选用适用范围更广的单类药品残留量检测的国家推荐性标准GB/T 21317。水产品中四环素类药物测定标准的选用原则是按照《食品安全监督抽检实施细则》[7]附注1.3 中的规定：食品安全国家标准有指定检验方法的，按照食品安全国家标准指定检验方法实施，故水产品的四环素类药物残留量检测方法选用GB 31656.11 第二法，而不选择同样适用的国家推荐性标准GB/T 21317。食用农产品中的鲜蛋产品（鸡蛋、其他禽蛋）检测多西环素，其标准的选用原则与水产品一致，选用GB 31659.2 食品安全国家标准作为检验方法，且多西环素为2023 年的新增检验项目，自2023 年2 月1 日GB 31659.2 标准实施开始检测。

2 四环素类药物残留限量与检验标准的定量限对比

四环素类药物在动物养殖过程中是允许使用的，故GB 31650—2019[8]食品中兽药最大残留限量标准中，按照不同动物种类、不同靶组织规定了多西环素的残留限量，土霉素、金霉素、四环素单个或组合的不同靶组织的限量，在畜禽肉及副产品、水产品中各靶组织的四环素类最低残留限量为100 μg·kg-1，最高残留限量为1 200 μg·kg-1。鲜蛋的多西环素残留限量的判定依据为《食品安全国家标准 食品中41 种兽药最大残留限量》（GB 31650.1—2022）[9]，其中家禽的蛋的最大残留限量为10 μg·kg-1。对于有残留限量规定的兽药，指定检验方法的定量限能否达到限量的要求，是国家标准不断更新的关注点，也是保证食品安全的关键。GB 31658.17 的定量限为10 μg·kg-1，GB/T 21317的测定低限位为50 μg·kg-1，GB 31656.11 第二法的定量限为10 μg·kg-1，均满足GB 31650 食品中兽药最大残留限量标准中规定的100 μg·kg-1的最低残留量要求。GB 31659.2 检测标准的定量限为2 μg·kg-1，满足GB 31650.1 标准中对家禽的靶组织蛋中的最大残留限量为10 μg·kg-1的要求。

3 4 种液相色谱-串联质谱法的前处理过程对比分析

4 个检测标准的前处理步骤主要为样品加Mellvaine-Na2EDTA 提取液，涡旋，超声提取，离心，提取液过固相萃取小柱净化，洗脱，氮吹，复溶液复溶，过膜上机。各检测标准的具体参数[3-6]如表1 所示。

表1 4 个检测标准前处理参数对比表

综上分析可知，4 个检测标准的提取步骤中，除GB 31658.17 与GB 31656.11 第二法不考虑该标准适用的样品基质外，GB/T 21317 的提取步骤分两种方法，一种适用于动物肝脏、肾脏、肌肉组织、水产品样品的提取，一种适用于牛奶样品的提取；GB 31659.2 检测标准的两种提取方法分别适用于禽蛋、牛奶和奶粉的提取。考虑GB/T 21317 与GB 31659.2 两个标准的两种提取方法大致相同，均采用第一法（样品基质环境复杂）与其余两个检测标准相比较。①4 个检验标准的样品量不同，提取步骤的最终体积各不相同，但实际提取液与过柱备用液之间存在稀释倍数，如GB 31656.11 第二法的提取步骤为样品量2 g，总提取液20 mL，取10 mL 提取液过柱净化，存在2 倍稀释关系。故除GB 31659.2 的样品量为2 g 外，其余3 个检验方法的最终上机质量均为1 g。②4 个检验标准的提取液均为Mellvaine-Na2EDTA 溶液，GB 31658.17的二次提取利用磷酸盐缓冲溶液提取，提取液的pH略微不同，提取液的浓度及配制方法大同小异。提取方式、离心条件方面的差异为超声时间、温度条件，离心温度、转速等具体参数的不同，超声的温度与时长主要与目标组分的化学性质、提取率有关。③4 个检测标准的离心条件多采用低温、高转速离心，既避免了油脂乳化的影响，又达到高效分离。④净化步骤均采用固相萃取小柱净化的方式，活化柱材后，采用不同的洗脱液洗脱，除GB 31659.2 标准采用甲醇作为洗脱液，其余3 个标准均采用甲醇-乙酸乙酯作为洗脱液，洗脱液比例与洗脱液体积不同。洗脱液氮吹后复溶，4 种复溶液均为高比例水相溶液，水相添加甲酸可以增加电离，有机相则为甲醇、乙腈或两种溶液不同比例的混合。

4 仪器设备与定量方法的比较分析

4 个检验标准的仪器均为带电喷雾离子源的液相色谱-串联质谱仪，该仪器既有液相色谱的强分离能力，又具备质谱的高灵敏度、分辨率的特性，能对分子结构相近的四环素类药物进行痕量分析。

4.1 液相色谱条件

液相色谱的主要技术参数为色谱柱的类型、流动相的配比与梯度洗脱程序、流速、柱温等。具体参数[3-6]如表2 所示。

表2 不同检测标准的液相条件表

对比分析可知，由于GB/T 21317 为2007 年的标准，存在当时色谱柱材料技术的局限，现在C18柱为最常用的色谱柱，且粒径越来越小，粒径越小分离效果越好。色谱柱的柱长与分离效果、分离时长有关，GB 31658.17 标准中50 mm 的短柱就能达到四环素类药物的有效分离。流动相方面，除GB/T 21317 外，其余的标准均选用0.1%甲酸溶液作为流动相的水相，甲酸与三氟乙酸均为挥发性酸，但是三氟乙酸的离子强度大于甲酸，容易造成分析物的解析，峰形改变，在液质联用时产生离子抑制效果，故低浓度的甲酸溶液为液相质谱仪的常用水相流动相。有机相多选用甲醇或乙腈，甲醇的极性强于乙腈，实验室方法开发时，乙腈如果能使目标物达到有效分离，就不会混合甲醇使用。流速对分离效果的影响为流速越小，分离效果越好，分离时间越长。柱温升高能提高分离效果，但是过高的柱温能引起分析物性质变化。

4.2 质谱条件的对比

4 个检测标准的离子源均为ESI 离子源、正离子扫描、MRM 检测方式，由于不同检测标准所用的液相质谱仪生产厂家、设备型号不同，在离子源温度、脱溶剂温度、毛细管电压、锥孔电压、碰撞电压等方面的参数只能作为参考使用，无对比性。定性、定量离子因仪器调谐参数不同，响应强度略有差异，导致同一目标分析物在不同检测标准中的定性、定量离子有差异，如多西环素在GB 31658.17 标准中子离子为410.2、428.2，在GB/T 21317 和GB 31656.11 第二法标准中为154、428，在GB 31659.2 标准中为321.0、154.0。

4.3 定量方法的对比

四环素类药物残留的测定均采用外标法定量，除GB/T 21317 外，其余3 种方法均采用配制基质标准曲线的方法来定量，基质标曲能够改善试剂标曲不能解决的基质效应，增加回收率的准确度。

5 结论与讨论

动物性食品营养成分复杂，脂肪、蛋白质含量高，前处理提取、净化中干扰因素多，基质效应明显。同时，兽药残留物具有同一类型兽药残留标志物性质相近，分子结构相似，同分异构体多，分离、定性、定量困难；不同类型兽药残留标志物的化学性质差异大，大部分兽药残留标志物性质不稳定，在动物体内极易代谢，产生代谢残留标志物的特点。难利用单一的前处理方法进行提取、定性、定量测定，多残留同时检测是目前学者研究的重点与热点。通过比较分析4 个四环素类药物残留量的检测标准发现，除了GB 31658.17 可以同时检测动物性食品中四环素类、磺胺类和喹诺酮类药物残留量，其余的检测方法均只能检测四环素类药物。而日常监督抽检的动物性食品中兽药残留的检测项目多，如磺胺类、喹诺酮类、β-受体激动剂类、四环素类、硝基呋喃类、氯霉素类等。现行有效的兽药残留标准大部分都是一类目标分析物一个检测标准，多残留同时检测的标准并不多，GB 31658.17 标准在利用短色谱柱，优化流动相配比与梯度洗脱程序、柱温的条件下，使磺胺类、喹诺酮类、四环素类多目标分析物达到10 μg·kg-1的定量限，为更多相似性质的兽药残留标志物的多残留检测优化标准检测方法提供了参考。

检测标准涵盖的样品种类不全面也是影响日常检验工作效率的重要因素。日常监督抽检涵盖样品种类多，若不同样品在检验相同目标物时执行不同的检测标准，前处理操作不能进行批处理，大大影响了检测效率。检测方法使用不当，也很容易出现超范围检验、精密度、准确度不达标的问题。在《食品安全监督抽检实施细则》（2023 年版）中，鸭肉、其他禽肉四环素类药物的测定，就和其他畜禽肉及副产品的检测方法不同，比较分析4 个检测标准的前处理步骤大致相同，目标分析物相同，可以优化提取、分离、净化条件来统一不同样品种类的前处理步骤，提高检验的批处理能力。