基于ERK/COX-2信号通路研究电针干预原发性痛经机制

李娟，刘余，薛晓，袁菡钰，汪少华，潘思安，岳增辉

湖南中医药大学针灸推拿与康复学院，湖南 长沙 410208

原发性痛经（primaiy dysmenorrhea，PDM）是以下腹部痉挛性疼痛为主要特征且无盆腔器质性病变的月经疼痛，并可放射至下背部或腿部，常伴随头痛、恶心、腹泻及尿频等症状。流行病学研究指出，不同年龄和国籍人群PDM发病率在45%～97%，严重影响患者日常生活[1]。关于PDM的主要发病机制，普遍认为与子宫前列腺素（PG）水平异常升高有关[2]。目前治疗以布洛芬为代表的非甾体抗炎药为主，但容易引起恶心、呕吐、胃灼热等不良反应[3]。大量研究表明，电针可以有效缓解PDM疼痛且治愈率高[4-6]，无明显不良反应，但其干预机制尚不明确。

丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）在细胞信号传递中具有十分重要的作用，经过受体、转录因子等因素的影响激活，将表面信号传导到核内部，控制细胞生长发育、分化、癌变、转移、凋亡、炎症等多种生命活动过程，成为许多疾病研究的重点[7-8]。MAPK可分为ERK、p38、JNK和ERK5共4个亚族。研究表明，MAPK/ERK信号通路是影响PDM发生发展的重要通路和调控因子[9-10]。环氧化酶-2（COX-2）是影响PGs释放的关键酶[11]，COX-2表达升高诱导PGs合成及释放，诱发炎症，导致疼痛[12]，下调MAPK/ERK信号通路相关蛋白COX-2表达能减少PGs释放，缓解痛经[13]。本研究通过建立PDM大鼠模型，基于ERK/COX-2信号通路研究电针治疗PDM的作用机制。

1 材料与方法

1.1 动物

SPF级健康未孕雌性SD大鼠40只，8～10周龄，体质量180～200 g，动物许可证号SCXK（京）2019-0008。饲养于室温20～25 ℃、湿度50%～70%环境，自由饮水进食，适应性饲养1周后开始实验。本研究经湖南中医药大学动物伦理委员会审批（LL2021040703），并遵循关于善待动物的指导意见。

1.2 主要试剂与仪器

布洛芬（批号13062，中美天津史克制药有限公司），苯甲酸雌二醇（批号2011052，4 mg/2 mL，宁波第二激素厂），缩宫素（货号P1029，纯度98.52%，美国Selleck），亚甲基蓝（货号C12086108，上海麦克林生化科技有限公司），HE染色试剂盒（货号C0105，中国生物技术），PGE2、PGF2α ELISA 试剂盒（货号20211111-J2944、20211111-J3106，湖南艾方生物科技有限公司），GAPDH 抗体（货号GB15002，武汉Servicebio），ERK1/2抗体（货号AF02700，湖南艾方生物），p-ERK1/2抗体（货号AF01038，湖南艾方生物），COX-2 抗体（货号GB11077-2，武汉Servicebio），HRP-山羊抗鼠二抗（货号GB25301，武汉Servicebio），HRP-山羊抗兔二抗（货号GB25303，武汉Servicebio）。

光学显微镜（型号BA410E，厦门Motic），切片机（型号UC7，德国Leica），酶标仪（型号RT-6100，美国Rayto），涡旋混匀仪（型号MV-100，武汉Servicebio），化学发光仪（型号6300，上海CLINX），电针仪（型号SDZ-V，苏州医疗用品有限公司）。

1.3 分组及造模

采用随机数字表法将40只大鼠分为空白组、模型组、电针组和布洛芬组，每组10 只。参照前期研究[14-15]优化造模方法：通过阴道涂片筛选处于动情间期大鼠造模，模型组、电针组和布洛芬组连续10 d于股部皮下注射苯甲酸雌二醇，第1、10日注射0.5 mL/只，第2～9 日注射0.2 mL/只，第11 日腹腔注射缩宫素2 U/只诱发扭体反应，空白组注射0.9%氯化钠溶液。以大鼠子宫收缩出现扭体反应为造模成功标准[16]。

1.4 干预

造模第1 日开始干预，电针组参考《实验针灸学》[17]选穴。将大鼠固定于鼠板，常规消毒后“三阴交”直刺约5 mm，两侧“三阴交”隔日交替电针，“关元”直刺约2 mm，得气后连接电针仪，连续波，频率50 Hz，强度以大鼠局部肌肉轻微抽动，不出现挣扎嘶叫为度。每日1次，每次20 min，连续10 d。布洛芬组予布洛芬生理盐水溶液（1.25 mg/mL）灌胃，0.8 mL/只，每日1次。空白组和模型组只捆绑，不做其他处理。

1.5 指标检测

1.5.1 扭体潜伏期、扭体次数及扭体评分测定

第11日注射缩宫素后，记录大鼠30 min内出现扭体反应的时间，即扭体潜伏期，记录出现扭体反应的次数。参照行为学评分标准进行扭体评分[18]：正常探查行为，0分；身体躯干斜向一侧，腹部因收缩向内凹陷，1分；后肢伸展，后爪背屈，躯干伸展伴盆骨方向旋转，2分；腹部肌肉收缩，后肢后伸，3分。

1.5.2 HE染色

观察大鼠扭体反应后，腹腔注射2%戊巴比妥钠（3 mL/100 g）麻醉大鼠，摘除子宫组织，用无菌手术剪将大鼠左右两侧子宫剪成6等份，每组随机选取5只大鼠相同位置子宫组织，放入4%多聚甲醛溶液中固定，其余子宫组织标号冻存。子宫组织经固定24 h后进行脱水、二甲苯透明、包埋、切片（5 μm），脱蜡后HE染色，鼠李胶封片固定。光学显微镜下观察子宫组织病理变化，并对其进行评分。评分标准[19]：无明显病理变化，0分；内膜出现坏死，1分；固有层水肿，2分；固有层腺体增多，3分；固有层炎症细胞浸润，4分；子宫肌层炎症，5分。

1.5.3 ELISA检测

取大鼠子宫组织，加入缓冲液，匀浆，3 000 r/min离心20 min（离心半径15 cm），取上清液，根据ELISA试剂盒说明书检测PGF2α和PGE2含量。

1.5.4 Western blot检测

每组随机选取6 只大鼠相同位置子宫组织（约50 mg）剪成小块，研磨机低温研磨，加入预冷裂解液和蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂裂解30 min，4 ℃、12 000 r/min离心10 min（离心半径63 mm），取上清液，BCA法蛋白定量，加入样品缓冲液，沸水浴10 min。上样后电泳，PVDF 膜转膜、封闭后，加一抗孵育：GAPDH一抗（1∶2 000）、ERK1/2一抗（1∶1 000）、p-ERK1/2一抗（1∶1 000）、COX-2一抗（1∶1 000），4 ℃孵育过夜。TBST洗膜，加二抗（1∶5 000），室温孵育60 min，ECL法显色曝光。以GAPDH为内参，计算目的蛋白相对表达量。

1.6 统计学方法

2 结果

2.1 电针对模型大鼠扭体潜伏期、扭体次数及扭体评分的影响

空白组无扭体反应。与空白组比较，模型组大鼠扭体次数、扭体评分增加（P＜0.01）；与模型组比较，电针组和布洛芬组大鼠扭体潜伏期延长（P＜0.01），扭体次数、扭体评分减少（P＜0.05，P＜0.01）。见表1。

表1 各组大鼠扭体反应比较（±s）

表1 各组大鼠扭体反应比较（±s）

注：与空白组比较，**P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.05，##P＜0.01

组别空白组模型组电针组布洛芬组扭体评分0 2.90±0.32**1.70±0.83#1.30±0.68##只数10 10 10 10扭体潜伏期/s 0 150.80± 21.18**457.80± 93.02##430.50±116.81##扭体次数0 42.80±10.70**11.60± 6.11#6.80± 4.94##

2.2 电针对模型大鼠子宫组织病理形态的影响

空白组大鼠子宫内膜上皮细胞排列完整，无明显空泡水肿等病理变化；模型组大鼠子宫内膜上皮细胞大量空泡样变性、坏死，且有中性粒细胞浸润、子宫内膜剥脱水肿及炎症，伴小动脉充血；电针组和布洛芬组大鼠子宫内膜上皮细胞较少空泡样变性、坏死，内膜剥脱范围较小，水肿、炎症程度减轻。见图1。与空白组比较，模型组大鼠子宫组织病理评分显著升高（P＜0.01）；与模型组比较，电针组和布洛芬组大鼠子宫组织病理评分显著降低（P＜0.05，P＜0.01）。见表2。

图1 各组大鼠子宫组织形态（HE染色，×100）

表2 各组大鼠子宫组织病理评分比较（±s，分）

表2 各组大鼠子宫组织病理评分比较（±s，分）

注：与空白组比较，**P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.05，##P＜0.01

病理评分0.80±0.45 3.80±0.84**1.60±0.55#1.40±0.55##组别空白组模型组电针组布洛芬组只数5555

2.3 电针对模型大鼠子宫组织前列腺素F2α 和前列腺素E2含量的影响

与空白组比较，模型组大鼠子宫组织PGF2α含量显著增加，PGE2含量显著减少（P＜0.01）；与模型组比较，电针组和布洛芬组大鼠子宫组织PGF2α含量显著减少，PGE2含量显著增加（P＜0.01）。见表3。

表3 各组大鼠子宫组织PGF2α、PGE2含量比较（±s，pg/mg）

表3 各组大鼠子宫组织PGF2α、PGE2含量比较（±s，pg/mg）

注：与空白组比较，**P＜0.01；与模型组比较，##P＜0.01

PGE2 368.263±25.123 251.399±12.972**353.092±51.616##348.866±24.911##组别空白组模型组电针组布洛芬组只数5555 PGF2α 100.699± 5.761 221.095± 7.053**124.843± 6.761##121.555±12.408##

2.4 电针对模型大鼠子宫组织ERK、p-ERK、环氧化酶-2蛋白表达的影响

与空白组比较，模型组大鼠子宫组织ERK1/2、p-ERK1/2、COX-2 蛋白表达显著升高（P＜0.01）；与模型组比较，电针组和布洛芬组大鼠子宫组织ERK1/2、p-ERK1/2、COX-2蛋白表达显著降低，差异有统计学意义（P＜0.05，P＜0.01）。见图2、表4。

图2 各组大鼠子宫组织ERK1/2、p-ERK1/2、COX-2蛋白免疫印迹

表4 各组大鼠子宫组织ERK1/2、p-ERK1/2、COX-2蛋白表达比较（±s）

表4 各组大鼠子宫组织ERK1/2、p-ERK1/2、COX-2蛋白表达比较（±s）

注：与空白组比较，**P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.05，##P＜0.01

COX-2 0.233±0.013 0.819±0.068**0.571±0.028##0.414±0.078##组别空白组模型组电针组布洛芬组只数6666 ERK1/2 0.277±0.036 0.715±0.061**0.429±0.072#0.465±0.080#p-ERK1/2 0.248±0.046 0.594±0.109**0.367±0.051#0.362±0.058#

3 讨论

中医学认为，PDM主要病机为气血亏虚，失于濡养经络脏器而引起疼痛。三阴交为足三阴脾、肝、肾经经气交汇之处，针刺此穴既可补益脾、肾、肝三经气血，又可通畅三经气血，使气血充养胞宫。关元位于脐下小腹部，为调理冲任二脉气血之要穴，具有温通濡养胞脉作用。两穴配伍为远近配穴，近端取关元可调节子宫局部经气，体现腧穴的近治作用，远端取三阴交起整体调节作用，体现腧穴的远治作用，可沟通机体上下经气，改善整体气血。因而两穴相伍可起到调冲任、理气血、通经止痛的效果[20]。课题组前期分析针刺治疗PDM的腧穴配伍规律，结果表明关元、三阴交出现频次最高[21]。因此，本研究观察结果显示，模型组大鼠扭体次数、扭体评分显著增加，出现扭体潜伏期，说明PDM造模成功；电针组和布洛芬组大鼠扭体次数、扭体评分显著降低，扭体潜伏期显著延长，表明疼痛症状明显减轻。

有学者认为，PGs分泌异常可导致子宫收缩、缺血、炎症及疼痛[2]。研究表明，PGF2α的异常释放作用于相应受体，导致平滑肌痉挛收缩、组织缺氧缺血、子宫内膜脱落，引起出血及疼痛，而PGE2能抑制子宫平滑肌收缩[22-23]。本实验结果显示，模型组大鼠子宫组织PGF2α含量显著增加、PGE2含量显著减少，电针组和布洛芬组PGF2α含量显著减少、PGE2含量显著增加，表明电针可能通过增加子宫组织PGE2含量、降低PGE2 含量缓解子宫强烈痉挛收缩，从而达到止痛效果。

COX-2 是参与PGs 合成的重要限速酶，月经前COX-2表达升高，可催化花生四烯酸转化为活性PGs，导致痉挛性疼痛。目前治疗PDM的临床药物如布洛芬，通过特异性抑制COX-2，降低PGs合成，减轻疼痛[24]。ERK 是细胞外调节蛋白激酶，包括ERK1 和ERK2，控制和调节细胞增殖、分化、凋亡等重要生理活动。研究表明，MAPK/ERK通路参与COX-2表达的调节，可通过抑制MEK1/2 和ERK1/2 磷酸化，降低COX-2表达[8]。本研究结果显示，模型组大鼠子宫组织ERK1/2、p-ERK1/2 及COX-2 蛋白表达明显升高，表明PDM的机制之一可能是激活MAPK蛋白启动信号传导通路，激活ERK1/2磷酸化，上调COX-2蛋白表达，增加PGs释放，从而引发痛经。进一步说明ERK/COX-2信号通路参与PDM的病理生理过程。经电针和布洛芬干预后，ERK/COX-2信号通路相关蛋白表达降低，且电针组与布洛芬组差异无统计学意义，表明电针与布洛芬疗效相当，提示电针可能通过抑制ERK/COX-2信号通路相关因子，减少PGs释放，从而治疗PDM。

综上所述，电针“三阴交”“关元”可缓解PDM大鼠疼痛症状，改善子宫病理损伤，其机制可能与抑制ERK/COX-2信号通路，降低PGs水平有关。今后将进一步从ERK信号通路上游进行研究，明确电针治疗PDM的作用机制。