海南地区居民冠心病的相关基因表达差异性分析

张顺利，谢彩婵，廖陆枭，陈永昆，张石龙，王小啟

（1.海南医学院第二附属院心血管外科，海南 海口 570311；2.云南省阜外心血管病医院心外科，云南 昆明 650000）

随着国家经济的快速发展，冠心病（coronary heart disease，CHD）的发病率也显著升高，发病年龄逐渐年轻化，冠心病已经成为全世界主要致死原因之一。冠心病的并发症多，如心绞痛、心律失常、心衰、血栓栓塞、心肌梗死，严重者可导致心脏骤停。治疗难度大，无论是药物治疗还外科手术治疗均不能根治。外科手术是目前治疗冠心病的最有效方法，然而，有研究发现，在1 年的随访中，经PCI 治疗的冠心病人中死亡率为1.6%，再次行血运重建率为5.9%；冠脉搭桥的病人死亡率为0.9%，再次行血运重建率3.9%［1］。根据世界卫生组2020 年发布的《全球卫生估计》报告，2019 年全球因心血管疾病死亡的人数为5 540 万人，而冠心病死亡人数占全球死亡人数的16%［2］。美国心脏协会2020 年心脏病和中风统计数据更新的报告表明2016 年美国在20 岁以上的成人中冠心病人数为18.2 百万人，总患病率为6.7%［3］。截止2018 年，心脏病成为美国所有死亡人数最多的疾病，冠心病的死亡人数在2017 年为365 914 人，死亡率为92.9%［4，5］。根 据《中 国 心 血 管 健 康 与 疾 病 报 告2021》［6］报告，中国的心血管病呈持续上升趋势，目前估计约3.3 亿，冠心病有1 139 万，2019 年中国城市居民冠心病死亡率为121.59/10 万，农村为130.14/10 万。2019 年中国心脑血管疾病的住院总费用为3 133.66 亿元。其中，心血管疾病的住院总费用为1 773.38 亿元，其中缺血性心肌病为1 256.25 亿元，反复的治疗给病人带来巨大经济负担。经过多年对冠心病的研究已经明确了，冠心病是一个复杂的多因素疾病，包括环境因素和遗传因素。Framingham 研究已经证实了一系列冠心病的危险因素，包括年龄、性别、家族史、吸烟、高血压、血脂异常和糖尿病等，被称之为冠心病的“传统危险 因 素”［7，8］。全 世 界 多 个 研 究 团 队 对 不 同 人 群 冠心病易感基因进行了全基因组关联分析研究（GWASs）发现了161 个冠心病易感基因/位点，有力地推动了冠心病遗传学的发展［9-12］。一项对超过20 000 对瑞典双胞胎的研究证实了近亲之间冠心病（CHD）的风险增加，并估计致命性CHD 的遗传率约为50%；另一项利用全基因组关联研究的方法对遗传率进行量化的分析同样估计了CHD 的遗传率为40%～50%［13］。

国内外对于载脂蛋白E 基因（ApolipoproteinE gene，ApoE）、载 脂 蛋 白B（ApolipoproteinB gene，APOB）、血 管 紧 张 素 基 因（Angiotensino gene，AGT）、血管紧张素转化酶基因（Angiotensin converting enzyme gene，ACE）、G 蛋白β3 亚单位基因（Guanine nucleotide binding protein subunit β three gene，GNB3）、亚甲基四氢叶酸还原酶基因（Methylene tetrahydrofolate reductase gene，MTHFR）、皮型一氧化氮合酶基因（Endothelial nitric oxide synthase gene，NOS3）、E-选择素基因（E-selectin gene，ESLE）、白细胞介素6 基因（Interleukin-6 gene，IL-6）、肿瘤坏死因子基因（Tumor necrosis factor gene，TNF）、血浆纤维蛋白原B 基因（Plasma fibrinogen B gene，FGB）研究的主流观点认为与冠心病有关，能导致冠心病的发病与进展，是冠心病的独立风险因素，这些冠心病相关基因有望在将来成为冠心病治疗的靶点。

随着对冠心病研究的深入，对于冠心病发病的早期预防越来越凸显出它的重要地位。“零级预防”近来被国内学者引入主要局限于心血管领域。“零及预防”最早由国外学者Toma Strasser 于1978 年提出的一个概念名称。Toma Strasser 认为应采取措施阻止心血管疾病风险因素的出现，从而预防风险因素在人群中的流行，进而预防心血管疾病的发生。“零级预防”的理念是指人的健康为中心，以健康或疾病风险因素发生前的防控为重点，强调从“新的生命出生之前”“风险未出现时”“病变未发生时”和“身体未衰老时”的全生命周期健康管理，与中医“治未病”的核心理念一致［14］。冠心病相关基因的表达存在个体、种族及地域的差异，因此对区域冠心病基因表达情况的深入了解，有助于为该区域冠心病高危人群的筛查提供一个科学的方法，有利于该地区冠心病的零级预防。中国作为一个统一的多民族的国家，各个民族间对于冠心病基因的表达也可能存在不同，因此，我们选取11 个国内外公认的与冠心病相关包含了冠心病的传统的风险因素的基因，研究他们在海南地区的表达情况，以期为海南居民提供一个早期筛查冠心病高危人群的方法，为海南人冠心病的“零级预防”提供一定的理论依据，改善医疗质量，综合提高海南地区冠心病的综合防控能力。

1 材料与方法

1.1 研究对象

本研究采用病例对照，选取了2020 年1 月1 日～2022 年6 月30 日，到自海南医学院第二附属医院心血管病外科和心内科就诊的住院患者，样本籍贯均为海南籍。本课题的研究内容符合赫尔辛基宣言的条款，并且通过了海南医学院第二附属医院医学伦理委员会审批。与患者签署相关知情同意书。

1.1.1 纳入标准 （1）2020 年1 月1 日～2022 年6 月30 日在海南医学院第二附属医院心外科或心内科就诊的成年住院病人；（2）籍贯是海南，在海南地区生活满30 年以上；（3）住院期间完善冠状动脉造影；

1.1.2 分组标准 按照《稳定性冠心病基层诊疗指南（2020 年）》冠心病诊断标准，造影结果证实心外膜下冠状动脉直径狭窄＞50%，且患者有典型的心绞痛症状或无创检查提示心肌缺血诊断为冠心病的病人归冠心病组；不符合该诊断标准的病人归为非冠心病组。

1.1.3 排除标准 （1）籍贯不是海南；（2）伴有严重感染、肝肾功能不全、肿瘤疾病、心衰、合并慢性感染风湿免疫系统疾病。

1.2 研究方法

1.2.1 临床资料的收集 收集所有研究对象年龄、性别、高血压病史、糖尿病病史、吸烟史、饮酒史、甘油三脂、低密度脂蛋白、高密度脂蛋白、胆固醇。吸烟史：根据1984 年WHO 对于吸烟标准界定，吸烟每日＞1 支，持续时间＞1 年，或者患者曾经吸烟，但戒烟时间＜10 年。饮酒史：饮酒每次＞100 g，每星期超2 次及以上，持续时间＞半年。

1.2.2 样本收集及处理 所有患者入院后48 h 内完善抽血，单独抽取3 mL 外周静脉全血放入含有抗凝剂的试管中，常温保存，当日即送往海南普瑞特科技有限公司基因公司完成相关基因提取及基因定量表达检测。

1.3 统计学处理

用统计学软件SPSS26.3 对数据进行处理，检验水准α=0.05.一般正态计量资料采用均数±标准差（±s）描述，非正态计量资料用中位数M描述，计数资料用率、构成比描述。符合正态分布的计量资料用t检验，不符合正态分布的计量资料用非参数检验，分类资料、计数资料用卡方检验。运用Spearman 相关性分析探讨冠心病基因表达量与冠心病、一般临床资料的相关性；探讨冠心病基因在两组人群的表达差异性；探讨高表达基因与一般临床资料的相关性；有差异的因素与冠心病组中高表达基因的相关性；冠心病中高表达基因与冠心病合并高血压、糖尿病、冠心病家族史的相关性。基因表达量采用Studentst检验检测是否有显著性差异，P＜0.05 表示有显著性差异，使用GraphPad Prism 8.0 作图。

2 结果

2.1 临床资料

冠心病组病例数（170），高于非冠心组病例数（55），在性别方面，冠心病组男性数（126）高于非冠心病组女性（26），非冠心病组女性数（26）低于男性数（29），并且两个组别之间性别比率存在差异，（P=0.03，P＜0.05）。吸烟史、饮酒史、糖尿病、高血压、冠心病家族史、年龄冠心病组均高于非冠心病组，并且两组间差异存在统计学（P＜0.05）。总胆固醇冠心病组高于非冠心病，两组差异有统计学差异（P=0，P＜0.05）。甘油三酯、低密度蛋白、高密度蛋白，冠心病组均低于非冠心病组，两组差异存在统计学差异（P＜0.05）。

表1 CHD 与NCHD 两组基线资料比较Tab 1 Comparison of baseline data between the CHD and NCHD groups

2.2 冠心病基因与冠心病的关系

由表2 发现冠心病与AGT基因呈负相关（r=-0.163，P=0.011，P＜0.05）、APOB基因呈正相关（r=0.75，P=0，P＜0.01）、FGB基因呈负相关（r=-0.163，P=0.011，P＜0.05），GNB基因呈负相关（r=-0.165，P=0.011，P＜0.05）、SELE基因呈负相关（r=-0.171，P=0.007，P＜0.01）、MHTHR基因呈负相关（r=-0.210，P=0.001，P＜0.01）、TNF基因 呈 负 相 关（r=-0.131，P=0.04，P＜0.05），与APOE、NOS3、ACE、IL6等 基 因 无 相 关 性（P＞0.05）。

表2 冠心病基因表达量与冠心病的相关性（斯皮尔曼 Rho）Tab 2 Correlation between coronary heart disease gene expression and coronary heart disease（Spearman Rho）

2.3 两组基因的表达情况

载脂蛋白B 基因（ApoB）在冠心病组中高表达t=7.816，P＜0.000 1（图1A）；AGT基因t=3.126，P=0.002 0（图1B、ApoE基 因t=3.641，P=0.000 3（图1C）、FGB基因t=3.384，P=0.000 8（如图1D）、GNB基 因t=3.337，P=0.001（图1E）、MTFHR基因t=3.937，P=0.000 1（图1F）、SELE基 因t=3.132，P=0.002（图1G）、TNF基 因t=2.585，P=0.010 4（图1H）在非冠心病组高表达；NOS3基因t=1.719，P=0.087（图1I）、IL6基 因t=1.755，P=0.080 6（图1J）、ACE基因t=0.584 5，P=0.559 5（图1K）在两组间的表达水平无统计学意义，见图1。

图1 两组患者基因表达相对大小Fig 1 Relative size of gene expression in two groups of patients

2.4 冠心病组高表达基因与血脂的相关性分析

冠心病ApoB基因与甘油三酯呈负向相关，相关系数（r=-0.461，P=0.000），与年龄呈正相关，相关系数（r=0.173，P=0.009），与总胆固醇呈正相关，相关系数为（r=0.499，P=0.000），与高密度脂蛋白呈负相关，相关系数（r=-0.181，P=0.007），与低密度脂蛋白呈负相关，相关系数（r=-0.143，P=0.031），见表3。

表3 载脂蛋白B 基因与血脂的相关性（斯皮尔曼 Rho）Tab 3 Association between apolipoprotein B gene and blood lipids（Spearman Rho）

3 讨论

冠心病因其发病率高，并发症多，不可根治，发病机制不清，花费高，对于病人来说经济负担重，对其机制、流行病学、风险因素、风险预测基因的研究，寻找早期识别冠心病的方法，进行早期干预，优化冠心病的治疗，一直吸引着各国科研研究者探索。海南位于我国最南端，地处亚热带，国内多个研究发现ACE基因多态性、AGT基因多态性、乙醛脱氢酶（ALDH）2 基因多态性、AOPE基因多态性、胆固醇转运蛋白（CETP）基因的突变、Klotho基因多态性、PCSK9基因的E670G 多态性、甾醇调节因子结合蛋白裂解激活蛋白（SCAP）基因异亮氨酸（Ile）796 缬氨酸（Val）多态性在海南地区人群中与冠心病相关，能增加冠心病的患病率及风险［15-20］。先前研究已经发现载脂蛋白B 与血液中脂质代谢存在明显的相关性，脂质代谢异常与冠心病的发生关系较为密切，载脂蛋白B 基因编码乳糜微粒及LDL的载脂蛋白，是冠心病的最强预测因子［21，22］。本研究发现在海南地区冠心病患者中，载脂蛋白B 基因与冠心病 呈 正相关关系（r=0.75，P=0.000，P＜0.01），与非冠心病组相比明显高表达，t=7.816，P＜0.000 1，提示载脂蛋白B 基因的表达量可以用于海南地区人群冠心病“零级预防”筛查，对于筛查出现载脂蛋白B 基因高表达的人群，可对其早期进行冠心病一级预防，进而优化海南地区冠心病的防控。本研究也发现在载脂蛋白B 基因与血液中总胆固醇呈正相关（r=0.499，P=0.000），提示载脂蛋白B 基因可能通过影响总胆固醇血浆浓度参与冠心病的发生过程。另发现与高密度脂蛋白（r=-0.181，P=0.007），低密度脂蛋白（r=-0.181，P=0.007）、甘油三酯呈负相关（r=-0.461，P=0），这与国外学者研究不同［22，23］。分析原因：（1）选取的样本都是住院病人，非自然状态下的冠心病人和健康人，这样就不能真实反映冠心病和对照组的差异；（2）冠心病组和非冠心病的划分依据目前临床上冠心病诊断“金标准”，对于不符合冠心病诊断“金标准”的病人划分为非冠心病组，就使得非冠心病组实际上纳入了冠心病的潜在病人，会影响两组人群实际冠心病的表达情况；（3）由于资金有限，纳入的样本量有限，进一步增大样本量可能会减小抽样误差；（4）冠心病的基因在目前发现与冠心病有关的基因达161个，大多在西方国家，在中国人群得到验证的基因9p21.3、12q21.33、6p21.32、4q32.1、2p24.1 等 位 点，提示存在地域和种族的差异。海南地处热带、种族较多，纳入种族的不同，也可能导致两组基因表达的不同。

AGT基因（P=0.015 8）、ApoE基因（P=0.012 6）、FGB基因（P=0.005）、GNB基因（P=0.015 1）、MTFHR基 因（P=0.011 9）、SELE基 因（P=0.005）、TNF基因（P=0.029 8）等在非冠心病组高表达，ACE基因（P=0.785 2）等在两组间的表达没有差异，这与云美玲等［16］、周代锋等［17］、张勇等［15］的研究结果不一致，考虑原因如下：（1）在非冠心病组纳入了经造影检查冠脉有狭窄不满足冠心病诊断标准的样本，这使得非冠心病组的样本可能也是冠心病的潜在患者，这样就使得两组基因表达没有统计学差异。制定更详细的纳入标准，可能会得到不同的结果。（2）选择的样本量较少，尤其是非冠心病组，增大样本量或许会出现不一样的结果。（3）不同人群具有不同的生活方式，暴露的危险因素不尽相同。

本研究结果的优势是同时研究了国内外比较认可的与冠心病相关的11 个基因，通过成熟的PCR技术测定这些基因在每个样本中的表达量，探讨在海南地区冠心病与非冠心病人群的表达差异，整个实验交由海南普瑞特科技有限公司测定，实验结果可靠。本研究存在如下不足：（1）纳入的样本量不够大，可能出现选择偏倚，应扩大样本量；（2）基因与环境可能存在着更为复杂关系未被发现，因此需要扩大影响因素的范围进一步研究；（3）在本研究中，这些基因对冠心病的发病不起作用或者起到很轻微的作用；（4）各基因表型及多态性在冠心病组和非冠心病组未进行探索，在后续的研究中可以继续研究。

综上所述，载脂蛋白B 基因是海南地区冠心病人群的一个高危因素指标，有可能丰富海南冠心病高危人群的筛查手段，能够改善目前的预防策略。AGT、ApoE、FGB、GNB、MTFHR、SELE、TNF等基因可能是海南非冠心病人群的保护基因，这些基因的高表达可能会降低冠心病的发生，仍需进一步研究。

作者贡献度说明：

张顺利：文章撰写；王小啟：文章修改及指导；陈永昆、廖陆枭及张石龙：负责数据收集。

所有作者声明不存在利益冲突关系。