4 个苹果品种的抗寒性评价

徐功勋 周佳 吕德国 秦嗣军

摘要：【目的】探究4 个具有亲代遗传关系苹果品种的抗寒性，明确能够反映抗寒性强弱的生理指标，为寒地苹果选育过程中优系快速筛选及抗寒栽培管理提供理论支持。【方法】以长富2 号、寒富、东光和龙帅休眠期1 年生枝为试材，分别在-15、-20、-25、-30、-35 ℃低温下处理24 h，并于4 ℃环境中缓冻24 h，测定膜结构稳定性、活性氧代谢和渗透调节物质生理指标，结合主成分分析综合评价影响苹果品种抗寒性差异的生理因素。【结果】随着处理温度的降低，4 个苹果品种的相对电导率和丙二醛（malonaldehyde，MDA）含量呈现升高趋势，抗寒性强的龙帅相对电导率在不同低温处理下均低于其他品种且变化较为平稳。相比于-15 ℃处理，长富2 号枝条中的O2.-和H2O2含量在-35 ℃时分别增加了38.07%和12.63%，显著高于其他品种。抗寒性越强的品种抗氧化酶活性越较高，且响应低温的速率较快。低温下抗寒性品种积累大量的可溶性蛋白质、游离脯氨酸和可溶性糖等渗透调节物质，各品种苹果枝条糖组分主要是蔗糖和山梨醇。在-25 ℃低温胁迫下，龙帅枝条中的葡萄糖和果糖含量大幅度升高，且显著高于其他品种。在主成分分析综合评价中，抗寒性由强到弱为龙帅＞东光＞寒富＞长富2 号，相对电导率、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性、可溶性蛋白质和可溶性糖含量对苹果的抗寒性影响较大。【结论】苹果1 年生枝中的相对电导率、SOD活性、可溶性蛋白质和可溶性糖含量在众多生理指标中对低温胁迫响应敏感，可用于杂交后代抗寒优系早期快速选择；龙帅作为寒富的后代抗寒性突出，可在寒地苹果产区推广应用。

关键词：苹果；抗寒性；主成分；综合评价

中图分类号：S661.1 文献标志码：A 文章编号：1009-9980（2023）04-0669-11

苹果（Malus domestica）是世界范围内被广泛种植的温带落叶果树。中国苹果的栽培面积和产量均位居世界前列，已经成为世界苹果生产第一大国。目前，中国的苹果产区已由传统的渤海湾产区、西北黄土高原产区扩大到西南冷凉高地、东北和新疆等特色苹果产区。传统苹果产区的生长周期气候条件适宜，产量和品质较高[1-2]；寒地产区以中小型苹果为主，风味浓郁，受当地消费者青睐，区域经济特色明显。东北寒地栽植的寒富等品种抗寒性较强，但是由于全球气候变暖出现延迟进入休眠或休眠期剧烈大幅度变温，导致抽条、花芽冻害等现象经常发生[3]。因此，有必要明确能够反映苹果抗寒性差异的关键性指标，探讨用于杂交后代抗寒优系快速选择的可行性方法，这对于加快优异抗寒品种选育、建立适于寒地栽培的技术体系以及促进区域特色果业经济发展具有重要意义。

露地寒冻法和生理生化指标测试法常用于植物的抗寒性评价[4]。其中，露地寒冻法主要根据植物在低温下的生长状况来评价其抗寒性，适用于田间、园林等规模较大的栽培场地，但是该方法周期较长且在自然条件下极易受到其他因素的干扰。生理生化指标测试法是将植物或离体器官进行人工模拟低温处理，通过观察、测定植物的形态结构和生理生化特征变化，并结合数理统计分析的方式综合评价植物的抗寒性，具有周期短、可重复性高等特点而被广泛应用。闫忠业等[5]对6 个苹果新品种进行抗寒性评价，发现在?20～?45 ℃的低温处理下，抗寒性最强的七月鲜1 年生枝条中的丙二醛（malonaldehyde，MDA）含量低且较稳定，过氧化物酶（peroxidase，POD）活性较高。于立洋等[6]通过电导法和电阻抗图谱法对8 种新疆野苹果优良无性系的抗寒性展开研究，发现M-3、M-6 和M-8 抗寒性較高，且具有较低的低温半致死温度和高萌芽率。张博等[7]通过主成分分析的研究结果表明，超氧化物歧化酶（superoxidedismutase，SOD）活性、脯氨酸含量和相对电导率均可作为评价新疆野苹果抗寒性的主要指标。前人研究也发现，无论是中间砧还是基砧，抗寒性强的砧木具有稳定的细胞膜结构，相对电导率与胁迫温度之间呈负相关，并且可以积累大量的可溶性糖、游离脯氨酸等渗透调节物质，同时SOD、POD、过氧化氢酶（catalase，CAT）和抗坏血酸过氧化物酶（aseorbateperoxidase，APX）的活性也相对较高[8-11]。此外，前人也对桃[12]、梨[13]、软枣猕猴桃[14]和樱桃[15]等不同果树进行了抗寒性鉴定。由此可知，用于抗寒性评价的指标较多，但其在不同品种中表现不一致，不便于直接应用。以东光作为母本、富士作为父本选育的寒富苹果已在辽宁、甘肃、陕西等传统富士系苹果栽植区以北的冷凉地区形成规模，栽培面积达到13.3 万hm2[16]，以寒富为母本、金红为父本选育的小果型品种龙帅在黑龙江等多地也有一定的发展规模[17]。笔者在本研究中以具有亲代遗传关系且因抗寒性而呈不同地理区域分布的苹果品种东光、长富2 号、寒富和龙帅为试材，比较1 年生枝条抗寒性生理指标差异，筛选能够反映亲代与子代抗寒性差异的关键指标，这对于杂交育种过程中通过测定实生后代与亲代之间关键性抗寒指标差异、快速选择优系以及针对性建立寒地栽培技术体系具有重要意义。

1 材料和方法

1.1 试验材料

试验材料栽植于沈阳农业大学校内果树栽培与生理生态团队科研基地（东经123° 34′ ，北纬41°49′）。2019 年进入休眠后采集东光、长富2 号、寒富、龙帅枝条进行沙藏备用，2020 年4 月中旬以单芽枝接的方式，将4 个品种的接穗高位嫁接（距地面60 cm）于田间4 年生平邑甜茶（Malus hupehensis）（嫁接口平均粗度为3～4 cm）上，生长期间正常管理。

1.2 试验处理

田间取样时期为2021 年1 月15 日，选择40 根长势良好且均匀的1 年生枝条，并依次用蒸馏水和去离子水冲洗干净，然后用纱布擦干，在剪口处涂抹菌清后用薄膜包裹，防止失水抽干。将采集的枝条平均分为5 组，每组8 根，分别进行-15、-20、-25、-30和-35 ℃冷冻处理，到达设定温度后保持24 h，然后置于4 ℃低温冰箱中解冻24 h。通过修枝剪将各品种1 年生枝剪成0.5～1 cm的枝段，且避开芽眼，一部分用于测定相对电导率，另一部分在液氮中速冻后置于-80 ℃超低温冰箱中保存，用于生理生化指标的测定。

1.3 生理指标的测定方法

采用雷兹电导率仪（DDS-307）测定相对电导率；MDA含量采用硫代巴比妥酸（thiobarbituric acid，TBA）法测定；利用羟胺氧化的方法测定O2-含量；利用氯化钛氧化的方法测定H2O2含量；用氮蓝四唑光化还原法测定SOD活性，用愈创木酚法测定POD活性，用紫外吸收法测定CAT 和APX活性；采用考马斯亮蓝法测定可溶性蛋白质含量；采用茚三酮显色法测定脯氨酸含量；采用蒽酮比色法测定可溶性糖含量；用高效液相色谱（high performance liquidchromatography，HPLC）法测定蔗糖、葡萄糖、果糖和山梨醇含量。

1.4 数据处理与分析

利用Microsoft Excel 2010 和GraphPad Prism9.0 软件处理试验数据并绘图，采用SPSS Statistics26.0 软件进行单因素方差分析（ANOVA），利用邓肯检验进行差异显著性分析（p＜0.05），并对数据进行标准化处理和主成分分析。

2 结果与分析

2.1 低温胁迫对不同品种苹果枝条膜结构稳定性的影响

2.1.1 不同温度处理对苹果枝条相对电导率的影响 如图1-A所示，随着温度的逐渐降低，不同品种枝条相对电导率呈现逐渐升高的趋势，变化趋势为S 型。其中，在-15 ℃时，长富2 号、寒富和东光枝条的相对电导率差异不显著，而龙帅显著低于其他品种。长富2 号的枝条相对电导率在-25～-35 ℃迅速升高，增幅为7.64%。在-30 ℃时，长富2号和寒富枝条的相对电导率相差最大，差值为5.75%。在-35 ℃时，各个品种枝条的相对电导率均达到最大值，长富2 号显著高于其他品种，龙帅与东光枝条的相对电导率差异不显著。

2.1.2 不同温度处理对苹果枝条MDA 含量的影响 如图1-B所示，随着温度的降低，各品种枝条的MDA含量不同程度增加。长富2号枝条始终保持较高的MDA含量，除了在-25 ℃时长富2 号与寒富枝条中MDA含量差异不显著外，在其他温度下长富2号枝条中的MDA含量与各品种差异显著。东光和龙帅枝条中MDA含量较低，在-20、-25、-30 ℃时两者枝条中MDA含量无显著差异，而在-15、-35 ℃时龙帅枝条中的MDA含量显著低于东光。

2.2 低温胁迫对不同品种苹果枝条活性氧代谢的影响

2.2.1 不同温度处理对苹果枝条O2.-含量的影响 低温胁迫下各品种枝条O2.-含量变化如图2-A 所示。随着温度的降低，不同品种枝条中O2.-含量变化趋势不同。长富2 号和龙帅枝条中的O2.-含量呈升高趋势，相比于-15 ℃，在-35 ℃时两者分别增加了38.07%和32.03%。而其他品种呈先降低再升高的变化趋势，寒富枝条中O2.-含量（w，后同）在-35 ℃时达到最大值，为25.8 μg?- 1；而东光枝条中O2.-含量在-30 ℃时达到最大值，为24.45 μg?-1。

2.2.2 不同温度处理对苹果枝条H2O2 含量的影响 如图2-B所示，低温胁迫下长富2 号、寒富和东光枝条中H2O2含量始终高于龙帅。其中，龙帅与长富2 号和寒富枝条中H2O2含量的差异均达到显著水平。此外，在-15～-25 ℃的低温处理下，长富2 号枝条中H2O2含量先升高后降低，而其他品种均持续升高；在-30～-35 ℃的低溫处理下，只有龙帅枝条中H2O2含量降低，降幅为3.00%。

2.2.3 不同温度处理对苹果枝条SOD 活性的影响 如图2-C所示，在-15 ℃时，不同品种枝条SOD活性虽然存在差异但不显著。在较低程度的低温处理下，各品种枝条SOD活性呈现升高的趋势，而后随着低温胁迫程度的加深，各品种枝条SOD活性降低。在-25～-35 ℃，长富2 号枝条SOD活性下降幅度最大，为20.40%；而东光下降幅度最小，为2.30%。

2.2.4 不同温度处理对苹果枝条POD 活性的影响 如图2-D所示，在-15、-20和-30 ℃时，寒富枝条POD活性均显著高于长富2 号和东光，然而在-25、-35 ℃时，各个品种枝条POD 活性差异不显著。此外，在-25～-30 ℃的低温处理下，长富2 号和东光枝条POD活性大幅度下降，降幅分别为9.7%和17.42%，而寒富和龙帅枝条POD活性大幅度升高，升幅分别为16.88%和10.97%。

2.2.5 不同温度处理对苹果枝条CAT 活性的影响如图2-E所示，低温胁迫下不同品种枝条CAT活性变化趋势不同。长富2号、东光和寒富均呈先升高后降低的趋势，分别在-25、-30和-25 ℃下达到峰值，而龙帅枝条CAT活性为持续升高的变化趋势，-35 ℃较-15 ℃活性升高了31.3%。此外，除了在-20 ℃时龙帅与东光枝条CAT活性差异不显著之外，在其他低温处理下龙帅枝条CAT活性均显著高于各个品种。

2.2.6 不同温度处理对苹果枝条APX 活性的影响 如图2-F 所示，随着低温胁迫程度的加深，4 个品种的APX活性均在-25 ℃达到峰值，但变化趋势不同。长富2 号呈现先增加后降低的趋势，而东光、寒富和龙帅的变化趋势为先降低再升高，最后又降低。各个品种枝条APX活性均在-35 ℃低温处理下最低，并且差异不显著。

2.3 低温胁迫对不同品种苹果枝条渗透调节物质含量的影响

2.3.1 不同温度处理对苹果枝条可溶性蛋白质含量的影响 如图3-A所示，在不同的低温胁迫处理下，各品种枝条可溶性蛋白质含量不同。长富2 号枝条可溶性蛋白质含量始终最低，除了在-30 ℃与寒富枝条可溶性蛋白质含量差异不显著之外，在其余低温处理下与各品种的差异均达到显著水平。此外，随着温度的降低，各品种枝条可溶性蛋白质含量变化趋势不同，龙帅枝条可溶性蛋白质含量持续升高，并在-35 ℃时达到最大值，相比于-15 ℃增加了42.24%，积累速度较快。

2.3.2 不同温度处理对苹果枝条游离脯氨酸含量的影响 如图3-B可所示，在不同的低温处理下，长富2号枝条始终保持较低的游离脯氨酸含量。在-15 ℃时寒富枝条游离脯氨酸含量最高，为0.28 mg?g-1；而在其他温度处理下，东光枝条游离脯氨酸含量最高，并且在-35 ℃时达到最大值，为0.34 mg?g-1；寒富与东光相比差异性不显著，为0.31 mg?g-1。

2.3.3 不同温度处理对苹果枝条可溶性糖含量的影响 如图3-C所示，随着低温胁迫程度的加深，长富2 号枝条可溶性糖含量始终最低，而龙帅枝条可溶性糖含量最高，并且在-30、-35 ℃时长富2 号和龙帅枝条可溶性糖含量均下降，降幅分别为46.27%和4.11%。寒富与东光枝条可溶性糖含量在-30 ℃时差异显著，而在其他温度处理下差异不显著。

2.4 低温胁迫对不同品种苹果枝条糖组分含量的影响

本研究中主要测定了可溶性糖组分中的蔗糖、葡萄糖、果糖和山梨醇含量。低温胁迫对不同品种苹果枝条蔗糖含量的影响如图4-A所示。随着温度的降低，龙帅枝条蔗糖含量持续升高，并在-35 ℃时达到最大值，为21.46 mg· g-1，而4 个品种枝条蔗糖含量差异不显著。在-30～-35 ℃时，寒富枝条蔗糖含量下降3.88%，而长富2 号、东光和龙帅枝条蔗糖含量分别升高3.18%、9.51%和4.23%。葡萄糖和果糖含量的变化如图4-B～C 所示，在-25 ℃时龙帅枝条葡萄糖和果糖含量急速升高，增幅分别为21.94%和52.5%，此后随着低温胁迫程度的加深，葡萄糖含量下降，而果糖含量变化平稳。在低温胁迫下，不同品种苹果枝条山梨醇含量变化趋势较为平稳，在-25、-30 ℃时各品种枝条山梨醇含量差异不显著，但是相比于其他品种，在各个温度下龙帅枝条山梨醇含量相对较高，如图4-D 所示。此外，低温胁迫下各品种苹果枝条糖组分含量主要是蔗糖和山梨醇，而葡萄糖和果糖较少。

2.5 不同苹果品种抗寒性的综合评价v2.5.1 低温胁迫对不同苹果品种各指标的主成分因子得分分析 在本研究中，通过SPSS 对-35 ℃低温处理的各项抗逆生理生化指标进行主成分因子分析，得到主成分特征值。如表1 所示，有2 个大于1的主成分，并且解释了全部方差的96.136%，说明提取的2 个主成分能够代表11 个指标信息的96.136%，所提取的主成分评价不同苹果品种的抗寒性有一定的合理性。同时由表2 可知，主成分1 主要反映相对电导率、MDA含量、H2O2含量、O2.-含量、SOD活性、POD活性、CAT 活性、APX活性、可溶性蛋白含量和可溶性糖含量10 个变量的信息。其中，系数绝对值前4 位是SOD活性（0.991）、可溶性蛋白质含量（0.989）、可溶性糖含量（0.986）和相对电导率（-0.986），主成分2主要反映游离脯氨酸含量的信息。2.5.2 不同苹果品种综合抗寒性评价通过SPSS将标准化的原始数据代入主成分表达式计算不同苹果品种的主成分得分，进而得出各个苹果品种的综合得分，分值越高则抗寒性越强。如表3 所示，各苹果品种抗寒性由高到低为龙帅＞东光＞寒富＞长富2 号。

3 讨论

冬季低温是影响苹果栽培区划的最主要环境因素。在休眠期间，长期的极低温度及早春的大幅度变温容易导致苹果发生冻害，培育抗寒品种及采取配套栽培技术体系是应对上述问题的主要策略，其前提条件是做好品种、品系的抗寒性评价工作。

3.1 低温胁迫与膜稳定性的关系

植物生物膜是感受低温的主要组织部位，同时也极易受到低温胁迫的伤害。在低温胁迫下生物膜的结构和功能发生变化，膜透性增大，选择透过性的作用降低，导致细胞内溶物外渗，细胞失水且膨压降低，严重时植株死亡[18]。前人研究发现，相对电导率可以反映细胞膜透性的变化，并作为抗寒性评价的重要指标已在冬油菜[19]、西瓜[20]、苹果[21]、梨[22]、枣[23]、葡萄[24]和柑橘[25]等植物上广泛应用。其中，由于不同植物的组织结构和胁迫作用机制不同，其低温处理下的相对电导率的变化范围也有很大的差异。在本研究中，抗寒性最强的龙帅相对电导率在不同低温处理下均低于其他品种，其变化范围为47.48%～54.39%，且变化趋势较为平缓；而抗寒性弱的长富2号相对电导率较高，并且在-25～-35 ℃时急剧升高，说明其在-25 ℃处理时细胞膜便开始损害严重，稳定性差。曹晓敏等[26]对6 个苹果砧木进行抗寒性评价发现，抗寒性强的烟砧6 号在-35 ℃时的相对电导率为46.53%，而抗寒性弱的M9 的相對电导率为61.39%，此时M9 的萌芽率仅为20.41%，显著低于烟砧6 号，由此可知相对电导率与枝条萌芽率呈负相关。MDA是膜脂过氧化的产物，其含量可以作为生物膜系统损伤程度的评价指标。刘兴禄等[27]发现在低温处理下，抗寒性弱的M26 和T337 苹果砧木MDA含量变化幅度大，且MDA含量相比于抗寒性强的SH1 较高。本试验结果与之一致，即抗寒性越强的品种，MDA含量越低，而抗寒性弱的长富2 号枝条MDA含量始终高于其他品种。由此说明，相对电导率越高，细胞膜损害程度越深，MDA含量越高，则抗寒性越弱。

3.2 低温胁迫与抗氧化系统的关系

当植物受到低温等非生物胁迫时，体内活性氧含量的动态平衡会被打破，从而积累大量的超氧阴离子等活性氧自由基，影响细胞膜系统的稳定性，降低蛋白质活性，最终导致植物代谢过程紊乱[28]。其中，SOD、POD、CAT和APX是植物体内重要的抗氧化酶，属于酶促抗氧化系统的重要组成部分，能够清除活性氧自由基，维持活性氧含量的动态平衡，保证植物正常的生命活动，进而增强植物的抗寒性[29]。田景花等[30]探究低温逆境对不同核桃品种抗氧化系统的影响，发现抗寒性强的哈特雷叶片中O2.-含量最低，叶片没有明显的冷害症状。在本研究中，虽然随着温度的降低，各品种O2.-含量总体上呈现升高的趋势，但是比较分析可知，抗寒性更强的龙帅升高幅度较小。此外，在-35 ℃低温处理下，龙帅枝条中H2O2含量变化趋势与各品种相反，呈现下降的趋势，这可能与龙帅枝条中的POD 和CAT 活性升高有关。

SOD是植物酶促抗氧化系统的第一道防线，能将O2.-转变为H2O2和O2，产生的过氧化氢会被POD、CAT、APX 协同清除，进而维持活性氧平衡[31]。范宗民等[32]在葡萄砧木的抗寒性研究中发现，SOD、POD和CAT 活性变化趋势不同，随着温度的降低，SOD 活性不稳定，呈现M型的变化趋势，POD活性则先升高后下降，而CAT 活性持续升高，进而清除细胞内过量的活性氧，保证细胞代谢稳定。孟诗原等[33]探究卫矛属植物对低温胁迫的生理响应，指出抗寒性强的植物具有较高的抗氧化酶活性。本研究结果表明，随着低温胁迫程度的加深，抗寒性强的龙帅SOD 活性显著高于其他品种，CAT 活性持续升高，对低温响应剧烈，然而对于POD 和APX 而言，在-35 ℃ 时4 个品种的酶活性差异不显著，并且APX 活性在-35 ℃时大幅度下降，这与赵一航等[34]对紫花苜蓿的研究结果相似，分析认为当温度降低至植物承受的最低温度时，抗氧化酶活性会受到抑制，不再随着温度的降低而发生改变，也就是植物抗氧化酶活性在阈值内外存在差异。

3.3 低温胁迫与渗透调节物质的关系

可溶性蛋白质、游离脯氨酸和可溶性糖等渗透调节物质是植物响应非生物胁迫的重要物质，含量的积累与抗寒性呈显著正相关[35-37]。李清亚等[38]在豆梨响应低温胁迫的研究中发现，抗寒性强的克利夫兰在较低温度下能够积累更多的可溶性蛋白质，本试验结果与之一致。笔者研究发现，抗寒性弱的长富2 号枝条中可溶性蛋白质含量低，而抗寒性强的龙帅枝条可溶性蛋白质含量随着温度的降低而持续升高，高水平的可溶性蛋白质含量能够增强细胞的持水能力，降低细胞冰点，并且低温诱导产生的抗冻蛋白与植物的抗寒性密切相关[39]。因此，推测可溶性蛋白质含量的差异直接影响品种的抗寒性。游离脯氨酸能够维持生物膜和酶蛋白的结构稳定性，而且作为非酶促抗氧化物质清除逆境下大量生成的活性氧，增强植物的抗寒性[40]。试验发现游离脯氨酸含量与苹果的抗寒性呈正相关，即枝条游离脯氨酸含量越高，抗寒性越强，这与郭艳兰等[41]对6 个葡萄砧木品种抗寒性评价的研究结果一致。可溶性糖的积累可以提高胞液浓度，增强保水能力，防止低温下胞间结冰，并增强细胞膜的稳定性，同时也可以参与活性氧的清除[42]。刘胜元等[43]对不同花椒的抗寒性研究发现，低温处理下积累的可溶性糖含量与抗寒性呈正相关。在本研究中，抗寒性弱的长富2 号枝条可溶性糖含量始终低于其他品种，并在-35 ℃大幅下降，低温胁迫下积累较少的可溶性糖含量可能是长富2 号抗寒性弱的原因之一。此外，本研究还分析了不同品种枝条中蔗糖、果糖、葡萄糖和山梨醇含量在低温下的积累状况，试验结果表明，蔗糖和山梨醇含量在各品种中较高，且变化较为平稳。但是，在-25 ℃时，龙帅枝条中的葡萄糖和果糖含量大幅度升高，并显著高于其他品种，而后随着低温胁迫程度的加深，葡萄糖含量轻微下降，而果糖含量变化平稳。因此，较高含量的葡萄糖和果糖可能是龙帅具有抗寒性的原因之一。这与Zhao 等[44]发现抗寒性强的山葡萄在越冬期间积累大量的葡萄糖和果糖的结果一致。

4 结论

根据综合得分评价各苹果品种抗寒性为龙帅＞东光＞寒富＞长富2 号。分析发现相对电导率、SOD活性、可溶性蛋白质和可溶性糖含量对低温胁迫响应敏感，这些指标可用于杂交后代抗寒优系早期快速选择。龙帅作为寒富的后代抗寒性突出，可在寒地苹果产区推广应用。

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