基于网络药理学探究虎杖治疗糖尿病心肌病的作用机制

陈怡晴, 周 蕾

(南京医科大学第一附属医院心内科, 江苏南京 210029)

糖尿病的发病率逐年上升, 已成为全球十大死亡原因之一. 糖尿病不仅是引发脑卒中、冠心病等心血管疾病的独立危险因素, 还能够直接引起心肌损伤, 诱发糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy, DCM). DCM 独立于高血压、冠心病, 是一种由糖代谢紊乱导致的心脏结构和功能障碍为特征的心肌病变. DCM 在高血糖、高血脂刺激下引发心肌细胞凋亡、心脏成纤维细胞增殖和胶原沉积, 从而造成心室病理性重构、心脏收缩及舒张功能障碍等, 最终导致心力衰竭[1].

迄今有关糖尿病患者DCM 的确切发病机制尚不完全明确, 传统西药对DCM 尚无特效药物, 多以降低血糖、降血脂、促胰岛素分泌来改善心功能, 存在一定的副作用和局限性. 与此同时, 中医药治疗DCM 的研究备受关注, 其中虎杖(Polygonum cuspidatum) 具有多种有效活性成分, 包括白藜芦醇、虎杖苷和大黄素等[2], 能够改善DCM 的心肌损伤, 但其具体作用机制仍有待深入研究.

网络药理学利用生物信息学和数据库平台系统地将药物、疾病和靶点联系起来, 通过“药物-靶点-途径-疾病” 网络, 探究药物与疾病靶点间的作用关系, 为中药的多成分、多靶点、多通路研究提供参考依据. 因此, 如果能基于网络药理学的方法对虎杖的有效活性成分进行进一步的研究, 分析和预测作用靶点, 有望阐明虎杖在DCM 治疗中的潜在机制, 为临床中药防治DCM 提供新的思路和理论依据.

1 实验方法

1.1 虎杖化学成分和靶点筛选

通过中药系统药理学数据库与分析平台(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform, TCMSP)——http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php[3], 以口服生物利用度(oral bioactivity, OB)≥30%, 类药性(drug likenesss, DL)≥0.18 作为筛选条件收集虎杖的主要活性成分, 同时纳入已有明确报道的具有治疗DCM 功效的虎杖活性成分(白藜芦醇[4-7]、原儿茶酸[8]、虎杖苷[9-10]、齐墩果酸[11]和大黄素[12]). 使用PubChem 数据库(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)[13]检索获得虎杖活性成分的简化分子线性输入规范(simplified molecular input line entry system, SMILES) 结构, 并将其导入Swiss Target Prediction 数据库(http://www. SwissTargetPrediction.ch/)[14]预测其潜在的作用靶点. 将结果取并集去重后得到虎杖所有可能的作用靶点.

1.2 虎杖治疗DCM 作用靶点筛选

在GeneCards 数据库(http://www.genecards.org)[15]和在线人类孟德尔遗传(online Mendelian inheritance in man, OMIM) 数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/omim)[16]中输入关键词“diabetic cardiomyopathy”进行检索,将结果取并集去重后获得DCM 相关的疾病靶点. 将其与筛选出的虎杖活性成分输入Venny 2.1.0 在线作图软件(http://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html) 绘制Venn 图, 获得虎杖活性成分与DCM 的交集靶点.

1.3 虎杖-有效成分-交集靶点网络构建

将虎杖活性成分、预测靶点以及虎杖活性成分与DCM 的交集靶点导入Cytoscape 3.9.1软件(https:// cytoscape.org/), 构建虎杖-有效成分-交集靶点网络. 网络中的节点分别代表药物、有效成分、靶点; 节点之间的连线代表两两节点之间存在相互作用.

1.4 蛋白相互作用(protein-protein interaction, PPI) 网络构建

将筛选得到的虎杖活性成分与DCM 的交集靶标蛋白导入String 数据库(https://stringdb.org/)[17], 设置种类为“Homo sapiens”, 设置置信度为“Highest confidence”(0.900), 隐藏离散靶点, 绘制PPI 网络图, 将结果导入Cytoscape 3.9.1 软件中进行可视化, 获得PPI 网络中的关键靶点.

1.5 基因本体论(gene ontology, GO) 富集分析和京都基因与基因组百科全书(Kyoto encyclopedia of genes and gnomes, KEGG) 富集分析

利用注释、可视化和集成发现数据库(the database for annotation, visualization and integrated discovery, DAVID) 在线分析工具(https://david.ncifcrf.gov)[18]对虎杖活性成分与DCM 的交集靶点进行GO 和KEGG 富集分析, 并将得到的数据分析导入微生信在线绘图网站(http://bioinformatics.com.cn/) 绘制气泡图.

2 实验结果

2.1 虎杖活性成分及其靶点信息

为了获得虎杖的有效活性成分, 本实验利用TCMSP, 以OB ≥30% 和DL ≥0.18 为筛选参数, 共收集到了9 个满足条件的虎杖有效活性成分, 并结合已报道的与DCM 相关的虎杖活性成分, 综合筛选确定了15 个虎杖的有效化合物(见表1). 将得到的化合物输入PubChem数据库获得其SMILES 结构, 再将SMILES 结构输入Swiss Target Prediction 数据库得到预测靶点772 个, 其中化合物(+)-catechin 未预测到靶点, 删除重复值后共得到359 个虎杖的有效作用靶点.

表1 虎杖活性成分信息Table 1 Information on the active constituents of Polygonum cuspidatum

2.2 虎杖活性成分与DCM 交集靶点的获取

在GeneCards 数据库以及OMIM 数据库中输入关键词“diabetic cardiomyopathy”, 寻找DCM 的疾病靶点. 将两个数据库得到的预测靶点汇总并去除重复值后, 共获得DCM 可能的疾病靶点5 042 个. 随后使用Venny 2.1.0 在线作图软件将DCM 的靶点与虎杖活性成分靶点取交集, 得到虎杖治疗DCM 的潜在靶点214 个(见图1).

图1 虎杖活性成分与DCM 交集靶点的Venn 图Fig.1 Venn diagram of the intersection targets bewteen DCM and the active constituents of Polygonum cuspidatum

2.3 虎杖-有效成分-交集靶点网络构建

将虎杖活性成分、预测靶点以及虎杖活性成分与DCM 的交集靶点导入CytoScape 3.9.1软件, 去除孤立的节点后获得“药物-活性成分-靶标” 网络(见图2). 由图可知: 围绕药物虎杖呈环形排列的节点是虎杖的主要活性成分, 下方矩形排列的节点代表作用靶点; 颜色越深、图形越大, 代表存在的相互作用越多.

图2 虎杖-有效成分-交集靶点网络Fig.2 Network of Polygonum cuspidatum-active constituents-intersection targets

2.4 虎杖治疗DCM 作用靶点的PPI 网络构建

将虎杖活性成分与DCM 的交集靶点导入String 数据库构建PPI 网络, 设置置信度大于0.900, 并隐藏孤立的蛋白. 将结果文件导入CytoScape 3.9.1 软件, 使用内置插件Analyze Network 计算度值, 并选择度值大于平均值的靶点作为连接PPI 网络中其他节点的枢纽.绘制虎杖活性成分与DCM 交集靶点的可视化PPI 网络图(见图3). 由图可知: 度值越大的节点颜色越深、形状越大、涉及的生物功能越多, 其中SRC(度值37)、HSP90AA1(度值34)、MAPK3(度值30)、HRAS(度值29)、PIK3CA(度值28)、Akt1(度值25) 等靶点在PPI 网络中的连接节点数远高于其他靶点, 可能是虎杖治疗DCM 的核心作用靶点.

图3 虎杖活性成分与DCM 交集靶点的PPI 网络Fig.3 PPI network of the intersection targets between the active constituents of Polygonum cuspidatum and DCM

2.5 虎杖活性成分和DCM 交集靶点的GO 和KEGG 富集分析

利用DAVID 数据库对虎杖活性成分与DCM 的交集靶点进行GO 富集分析, 设置P < 0.05, 并选取排名前10 的通路绘制气泡图(见图4). GO 富集分析从生物学过程(biological process, BP)、分子功能(molecular function, MF)、细胞组成(cellular component,CC) 3 个方面对虎杖治疗DCM 的作用靶点进行标准化描述, 以探究交集靶点富集的生物学功能、途径以及细胞定位. 生物学过程主要包括: 对药物的反应、对异种刺激的反应、蛋白质磷酸化、MAP 激酶活性的正向调控、蛋白质自磷酸化、肽基酪氨酸磷酸化、凋亡过程的负向调控、衰老、缺氧反应、MAPK 级联的正向调控等. 分子功能主要包括: 酶结合、RNA 聚合酶II 转录因子活性、配体激活的序列特异性DNA 结合、蛋白酪氨酸激酶活性、跨膜受体蛋白酪氨酸激酶活性、ATP 结合、同蛋白结合、蛋白激酶活性、类固醇结合、血红素结合、锌离子结合等. 细胞组成主要包括: 质膜、膜筏、神经元细胞体、细胞质、受体复合物、质膜整体组分、胞浆、大分子复合物、膜、线粒体等.

图4 虎杖活性成分与DCM 交集靶点的GO 气泡图Fig.4 GO bubble map of the intersection targets between the active constituents of Polygonum cuspidatum and DCM

利用DAVID 数据库对虎杖活性成分与DCM 的214 个交集靶点进行KEGG 富集分析.设置Count ＞3, 筛选得到162 个结果, 选取前20 条通路绘制气泡图(见图5). 由图可见: 虎杖活性成分靶点主要富集在脂质和动脉粥样硬化通路、糖尿病并发症AGE-RAGE 信号通路、IL-17 信号通路、HIF-1 信号通路、胰岛素抵抗通路、PI3K-Akt 信号通路、凋亡通路等信号通路. 这一发现提示, 虎杖活性成分可能通过参与调控脂质代谢、胰岛素抵抗、抑制心肌细胞凋亡等实现改善糖尿病患者心脏功能的作用.

图5 虎杖活性成分与DCM 交集靶点的KEGG 气泡图Fig.5 KEGG bubble map of the intersection targets between the active constituents of Polygonum cuspidatum and DCM

3 讨 论

虎杖作为传统中药, 含有多种化学活性成分. 已有研究表明, 虎杖提取物可用于调节血糖和脂质代谢[19]. 虎杖成分复杂, 具有多靶点、多通路作用的特点, 导致其存在作用靶点不清楚,作用机制不明确的问题. 本实验利用网络药理学的方法深入探究了虎杖治疗DCM 的活性成分和潜在靶点, 构建了药物与疾病靶点网络, 从整体层面研究了中药作用于疾病的分子机制,为虎杖治疗DCM 的临床应用提供了理论依据和研究思路.

本实验通过数据库平台和已有文献挖掘出了15 个可能作用于DCM 的虎杖有效活性成分, 包括6,8-二羟基-7-甲氧基-双苯吡酮、囊毒碱、鸭脚树叶醛碱、大黄素甲醚双葡萄糖苷、大黄酸、芦荟大黄素8-葡萄糖甙、β-谷甾醇、(+)-儿茶素、木犀草素、槲皮素、白藜芦醇、原儿茶酸、虎杖苷、齐墩果酸、大黄素. 木犀草素可以通过抑制NF-κB、激活Nrf2、提高心肌组织活力和锰超氧化物歧化酶活性来降低心肌炎症和氧化应激, 从而缓解糖尿病引起的心功能障碍[20-22]. 槲皮素可以减少DCM 的炎症作用和甘油磷脂代谢失调来改善心功能障碍和心肌纤维化[23]. 白藜芦醇通过激活SIRT1 和使PGC-1α 去乙酰化来改善糖尿病患者高糖诱导的心脏氧化应激、线粒体功能障碍[24]. 原儿茶酸可以减少DCM 大鼠促炎细胞因子分泌, 恢复心肌功能[8]. 虎杖苷通过上调SIRT3、增加自噬通量、改善线粒体生物能来减轻糖尿病小鼠的心功能障碍[9]. 大黄素可以诱导心肌Akt 和GSK-3β 磷酸化水平增加, 对DCM 具有保护作用[12].这些实验数据进一步证实了网络药理学的准确性和可靠性.

本实验通过SMILES 结构预测获得了359 个潜在靶点, 其中214 个靶点为虎杖活性成分与DCM 的交集靶点. 构建了虎杖有效活性成分和DCM 交集靶点的PPI 网络进行可视化分析, 其中SRC、HSP90AA1、MAPK3、HRAS、PIK3CA、Akt1 等靶点在PPI 网络中的相互作用关系数远高于平均, 是虎杖治疗DCM 的关键作用靶点, 其中PIK3CA 可能通过调节PI3K-Akt 信号通路在DCM 中发挥心脏保护调节因子的作用[25]. 根据KEGG 气泡图可知, 交集靶点主要集中在脂质和动脉粥样硬化通路、糖尿病并发症中的AGE-RAGE 信号通路、IL-17 信号通路、HIF-1 信号通路、胰岛素抵抗通路、PI3K-Akt 信号通路、凋亡通路等.已有研究已证实, DCM 与糖代谢紊乱密切相关, 高糖血症的同时伴随着胰岛素抵抗, 易发生氧化应激, 产生较多糖基化产物, 导致心肌纤维化和心肌细胞凋亡增加[1,26]. IL-17 的增加会导致糖尿病小鼠心脏炎症和心肌纤维化增加, 抑制IL-17 可以改善纤维化相关的DCM 心脏功能[27]. HIF-1 参与葡萄糖利用和血管生成, 有助于糖尿病心脏保护[28]. 此外激活PI3K-Akt信号通路对心肌细胞凋亡具有抑制作用, 可以促进心肌存活、改善DCM 心功能障碍[29]. 由此可见, 虎杖活性成分可能通过参与调节脂质代谢、调控胰岛素抵抗、减轻炎症反应和心肌细胞凋亡来达到缓解DCM 的作用.

综上所述, 本实验通过网络药理学的方法, 基于数据库平台挖掘虎杖治疗DCM 的有效活性成分及潜在靶点, 系统研究了多成分、多靶点、多通路间的复杂网络互相合作关系, 为虎杖治疗DCM 的潜在分子机制提供了研究方向, 也为探究其后续临床应用提供了理论基础.