烟草转录因子NtNAC080在非生物胁迫下的表达分析及功能鉴定

文利超 熊 涛 邓智超 刘 涛 郭 存 李 伟 郭永峰

烟草转录因子在非生物胁迫下的表达分析及功能鉴定

文利超1,2熊 涛3邓智超1,2刘 涛1,2郭 存4李 伟1,*郭永峰1,*

1中国农业科学院烟草研究所/ 烟草行业基因资源利用重点实验室, 山东青岛 266101;2中国农业科学院研究生院, 北京 100081;3湖北省烟草公司恩施州公司利川市分公司, 湖北恩施 445000;4云南省烟草公司昆明市公司石林分公司, 云南昆明 650000

NAC作为植物特有的转录因子, 广泛参与植物生长发育、衰老及胁迫响应等生物学过程。为探究烟草在非生物胁迫响应中的功能, 利用qRT-PCR技术分析了不同胁迫处理下的表达模式, 结果表明,的表达受干旱、高盐胁迫以及ABA、MeJA和SA激素的诱导; 以基因的敲除突变体及野生型(K326)烟株为材料, 分析敲除株系在高盐和干旱胁迫下抗逆表型。试验表明, 与野生型相比, 2个敲除株系的耐盐抗旱能力均明显增强; 干旱和盐胁迫下敲除株系的抗氧化酶(SOD、POD、CAT)活性以及可溶性蛋白、脯氨酸含量显著高于野生型, 而丙二醛含量显著低于野生型。相反地, 异源表达的转基因拟南芥与野生型(Col-0)相比对盐和干旱的耐受性明显减弱。qRT-PCR分析发现在干旱和盐处理后胁迫相关基因(、、等)在基因敲除株系中表达水平显著高于野生型。以上结果表明,在烟草的非生物胁迫响应中起负调控作用, 这可能是通过调控抗氧化酶活性及胁迫相关基因的表达来实现的。

烟草;; ROS; 表达分析; 非生物胁迫

干旱和盐胁迫一直以来都是农作物在生产过程中最常遇到的胁迫类型[1], 对农业及其他产业的正常运转造成重大影响。已有的数据表明, 全世界已存在的盐渍化土地已接近8亿公顷, 灌溉农业地中约有20%正在遭到盐碱化的危害[2]。盐渍化耕地在我国的面积已达到920.9万公顷, 且能被改良再利用的耕地仅占极少部分[3]。近年来随着全球气候变暖的加剧, 我国干旱地区的面积也日益增加, 部分地区降雨不充分导致农作物受到严重的干旱威胁, 而烟草作为我国重要经济作物之一, 其产量和质量一直以来受干旱和盐害的影响较大[4]。因此, 研究烟草应答干旱和盐胁迫的分子机理具有重要的理论和实践意义。

干旱、高盐、高温等非生物胁迫造成植物叶片光合系统受损, 光合速率降低; 还会诱导植物体内的活性氧(ROS)大量积累, 最终导致植物细胞严重损伤, 加速植物组织器官衰老等过程[5-6]。同时, 植物也不断进化出多种复杂的防御机制来抵御和适应逆境胁迫, 以便于保证自身正常的生长和发育过程。已有大量的研究表明, 多个转录因子参与调控植物的逆境应答过程, 如NAC、WRKY、MYB及bZIP等。这些转录因子通过与靶基因启动子的特定顺式元件结合引起基因表达变化, 从而导致靶基因的激活或抑制[7-8]。其中, NAC转录因子广泛分布于高等植物中并参与多种生物学过程, 研究表明该家族成员不仅对植物发育成长进程有着重要的调控作用, 在植物的逆境胁迫应答进程中也发挥着不同的功效[9]。人们利用RNA-seq技术分析水稻NAC转录因子的表达模式时发现, 不同生物和非生物逆境胁迫刺激会诱导至少45个水稻NAC基因的表达[10]; 对诱导表达的转录因子进行功能分析发现, 过表达、、及等基因会显著增强转基因水稻植株对外界胁迫的耐受性[11-14]。在拟南芥中, 多个NAC转录因子也被证明参与了植物逆境应答过程, 如、、或()转录因子的过表达增强了拟南芥对干旱、高盐和温度胁迫的耐受性[15-17]。此外, 研究表明在盐、低温和干旱胁迫下, 小麦的表达显著增加, 在拟南芥中过表达该基因可以诱导胁迫应答基因的表达从而增强植株对干旱、盐和低温胁迫的耐受性[18]; 在小麦中过表达基因可以诱导应激基因和脱水响应基因表达来提高植株的抗逆性[19]。番茄NAC转录因子和能够有效增强植物对盐、干旱和低温的抗性[20-21]。烟草中及的过表达会提高CAT、SOD及POD的活性从而增强转基因烟草对ROS的清除能力进而提高烟草植株对干旱胁迫的抗性[22-23]。

本课题组前期鉴定到了一个参与烟草叶片衰老调控的NAC转录因子基因, 该基因在叶片衰老过程中显著上调表达; 利用CRISPR-Cas9技术定向敲除烟草基因后能够延缓叶片衰老过程[24]。本研究发现也受干旱和盐胁迫诱导, 预示着该基因可能参与非生物胁迫应答过程。进一步, 本研究在干旱和盐胁迫下对转基因材料的抗逆性进行分析, 为解析烟草NAC转录因子在植物非生物胁迫应答中的分子机制提供一定的理论依据, 也为筛选和培育优质耐盐抗旱烟草新种质以及作物抗逆性的改良提供重要的参考价值。

1 材料与方法

1.1 试验材料与试剂

拟南芥Col-0和转基因植株在植物培养箱(加拿大Conviron)中生长, 培养条件为: 22℃, 长日照(16 h光/8 h暗), 白炽灯光照强度(120 µmol m–2s–1)。敲除株系和野生型K326种植在中国农业科学院烟草研究所温室。

植物RNA提取试剂盒购自康为世纪生物科技股份公司, 反转录试剂盒、荧光定量试剂购自宝生物工程(大连)有限公司, 由深圳华大基因科技有限公司合成引物。

1.2 试验方法

1.2.1 基因表达模式分析 K326种子用75%乙醇浸泡20 s, 无菌水冲洗2次, 15% H2O2浸泡8～ 12 min, 无菌水冲洗4～5次, 将无菌种子接种于MS培养基上进行种子萌发。幼苗长出4片真叶时, 选取长势均匀的幼苗转移到MS液体培养基中, 进行200 mmol L–1NaCl、150 μmol L–1脱落酸(abscisic acid, ABA)、150 μmol L–1水杨酸(salicylic acid, SA)及150 μmol L–1茉莉酸(jasmonic acid, JA)处理0～ 48 h。干旱处理时, 将幼苗置于滤纸上, 室温脱水0、1、3、6、12 h。取样后液氮速冻, –80℃保存。提取处理后烟草幼苗总RNA并反转录为cDNA, 每个处理设置3个生物学重复。

利用实时荧光定量PCR (qRT-PCR)方法对烟草、、、、、及拟南芥、、、、基因表达模式进行分析, 分别选择和作为烟草和拟南芥的内参基因。根据基因的编码序列设计荧光定量引物(表1), qRT- PCR在ABI7500 (美国ABI公司)仪器中进行, 采用2–∆∆Ct方法分析基因的相对表达情况。

1.2.2 烟草和拟南芥干旱胁迫处理 将2个敲除株系与K326种子同时播种在育苗盆中, 2周后挑选大小一致的植株移栽到花盆里, 烟苗生长到五叶一心时停止浇水, 进行干旱处理12 d后复水。试验设置3个生物学重复。

拟南芥2个过表达株系与Col-0同时播种在育苗盘内(营养土∶蛭石=3∶1), 幼苗生长到4周时停止浇水。进行干旱处理7 d后复水。试验设置3个生物学重复。

1.2.3 烟草和拟南芥盐胁迫处理 经表面消毒的及K326种子接种在MS培养基上竖直培养, 2周后挑选长势大小一致的幼苗小心地转移至分别含有0、50、100、150和200 mmol L–1NaCl的MS培养基上继续生长, 培养皿竖直放置于人工气候培养室, 培养条件为光照16 h/黑暗8 h, 培养2周。观察幼苗在模拟盐胁迫条件下根的生长发育情况, 照相并统计根长, 每个处理设置3个生物学重复。

拟南芥种子在超净工作台中进行种子表面消毒,具体步骤为75%的乙醇处理5 min, 无水乙醇处理1 min, 消毒完后的种子置于滤纸上完全晾干, 将无菌种子分别接种于0、100和150 mmol L–1NaCl的1/2 MS培养基上进行种子萌发, 观察1周内种子的萌发情况并照相记录。每个处理设置3个生物学重复。

1.2.4 植株生理指标测定 按照参考文献测定[25]超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、过氧化物酶(peroxidase, POD)活性及丙二醛(malonic dialdehyde, MDA)含量, 根据文献方法测定[26]过氧化氢酶(catalase, CAT)活性, 磺基水杨酸测定脯氨酸含量[27], 考马斯亮蓝法测定可溶性蛋白含量, 采用NBT染色法检测超氧阴离子含量(索莱宝, 中国)。

1.3 数据处理

通过Microsoft Excel和SigmaPlot 14.0软件进行数据整理和分析, 用SPSS 20.0软件进行显著性检验分析。

2 结果与分析

2.1 NtNAC080表达模式分析

本研究利用qRT-PCR方法在烟草不同组织器官中的表达模式进行分析发现,的转录水平在下部叶片中最高, 在顶芽中表达量极低(图1-A)。此外,在上部叶、中部叶、根、茎和花中表达量较高。为研究在非生物胁迫应答中的作用, 本研究进一步研究了在盐胁迫和干旱胁迫下的表达模式。盐和干旱胁迫处理均可显著诱导的表达(图1-B, C)。同时, 我们分析了外源激素处理下的表达情况发现, ABA及SA处理后,的表达量持续快速升高, 但MeJA处理后的表达量在1 h时急剧上升, 随后表达量均低于1 h (图1-D～F)。

表1 用于qRT-PCR分析的引物序列

图1 NtNAC080表达模式分析

LB: 侧芽; R: 根; S: 茎; UL: 上部叶; ML: 中部叶; LL: 下部叶; AP: 顶芽; F: 花。*表示在0.05概率水平差异显著。

LB: lateral bud; R: root; S: stem; UL: the upper leaf; ML: the middle leaf; LL: the low leaf; AP: the apical bud; F: flower. * means significant difference at the 0.05 probability level.

2.2 NtNAC080敲除增强了烟草植株的耐盐性

在正常生长条件下,敲除株系与K326根长没有明显差异, 盐胁迫条件下, 2个敲除株系根长明显长于对照K326。当NaCl浓度达到200 mmol L–1时, K326平均根长约为2 cm, 与正常生长情况下相比减少4 cm,敲除株系平均根长约为4.3 cm, 与正常生长情况下相比减少2 cm (图2-A, B)。表明基因敲除后增强了烟草植株对盐胁迫的耐受性, 因此基因可能作为一个负调控因子参与了植株对盐胁迫的响应。

植物体内的SOD、POD、CAT是生物膜保护酶系统的重要成员, 它们协同作用, 防御活性氧(ROS)或其它过氧自由基对膜系统的伤害, 抑制膜脂过氧化, 减轻干旱胁迫对细胞的伤害[28-29]。正常条件下, K326与敲除株系的SOD、POD, CAT酶活性没有明显差异, 盐胁迫条件下,敲除株系SOD、POD、CAT酶活显著高于K326, 且3种酶的活力随着盐浓度增大而逐渐升高, 且显著高于对照K326 (图2-C～E)。植物遭遇胁迫时体内的MDA含量会显著增加, 细胞内MDA含量可反映膜脂过氧化损伤程度和膜系统的完整性[32]。为抵御这些胁迫刺激, 植物通过增加可溶性蛋白来保持某些主要生物大分子的结构完整, 使细胞保持生物活性[29], 此外, 还会分泌一些游离脯氨酸来重建植物体内离子平衡, 防止细胞失水[30]。在正常条件下, K326与敲除株系MDA, 可溶性蛋白及脯氨酸含量没有明显差异(图2-F～H); 而在盐胁迫条件下,敲除株系MDA含量显著低于K326, 可溶性蛋白及脯氨酸含量显著高于K326。表明可通过影响SOD、POD、CAT抗氧化酶活性、MDA、可溶性蛋白及脯氨酸含量来降低盐胁迫对烟草幼苗的伤害。

2.3 NtNAC080敲除增强了转基因烟草植株的抗旱性

敲除株系与K326在干旱处理前生长状态基本一致。干旱处理12 d后, K326植株底部叶片变黄并干枯, 其余叶片缩小卷曲, 萎蔫严重。而敲除株系在干旱处理后表现出明显的抗旱表型, 仅底部第一片真叶表现出变黄干枯的表型,其余叶片略有萎蔫现象。复水3 d后, K326烟草叶片不能恢复到正常生长状态, 而敲除株系复水后能却能迅速地恢复到较为挺拔的生长状态(图3-A)。说明基因敲除后增强了烟草植株对干旱的抗性。

在干旱胁迫下,敲除株系SOD、POD、CAT酶活与K326相比均有显著性差异(图3-B～D), 说明烟草植株在干旱胁迫下能够提高与ROS清除相关酶的活性, 适应并减轻干旱对其造成的伤害。此外, 在干旱胁迫下,敲除株系中MDA含量显著低于K326 (图3-E), 说明在干旱胁迫下,敲除株系有一定的膜脂过氧化调节能力, 可明显降低干旱胁迫对烟草的膜脂过氧化程度, 维持膜的稳定性。

图2 烟草ntnac080敲除植株在盐胁迫下表型分析

A:敲除系和K326烟草植株在盐胁迫下的表型。B: 幼苗在含0、50、100、150和200 mmol L–1NaCl的MS培养基上生长2周的根长统计。C～E: 盐处理前后敲除系和K326烟草叶片中抗氧化酶活性(SOD、CAT和POD)分析。F～H: 盐处理前后敲除系和K326烟草叶片中MDA含量、可溶性蛋白含量以及脯氨酸含量。*表示在0.05概率水平差异显著。

A: phenotypes ofand K326 tobacco under control and NaCl treatment. B: seedlings were vertically cultivated on MS plates containing 0, 50, 100, 150, and 200 mmol L–1NaCl. C–E: POD, SOD, and CAT activities of K326 andmutant under various concentration of salt treatment. F–H: MDA, soluble protein, and proline contents of K326 andmutant under salt treatment. * means significant difference at the 0.05 probability level.

(图3)

A:敲除系烟草植株和K326在干旱胁迫下的表型。B～D: 干旱处理前后敲除系和K326烟草叶片中抗氧化酶活性(SOD、CAT和POD)分析。E: 干旱处理前后敲除系和K326烟草叶片中MDA含量。*表示在0.05概率水平差异显著。

A: phenotypes of tobacco plants treated with drought stress. B–D: POD, SOD, and CAT activities of K326 andmutant under drought treatment. E: MDA content of K326 andmutant under drought treatment. * means significant difference at the 0.05 probability level. 0D: 0 day; 12D: 12 days.

2.4 NtNAC080在拟南芥中过表达功能验证

为进一步探究在盐和干旱胁迫下的作用, 本研究在拟南芥中异源过表达基因并进行功能分析。qRT-PCR分析显示,在和株系中的转录水平分别是Col-0的200倍和486倍(图4-A)。本研究对拟南芥株系进行了耐盐性分析(图4-B, C)发现, 不加NaCl处理时种子的萌发率没有明显差异; 而100 mmol L–1和150 mmol L–1NaCl处理下,株系的发芽率显著低于Col-0,表明株系对盐胁迫更为敏感。盐胁迫往往会导致植物细胞产生过多的ROS。为明确耐盐性的降低是否与ROS水平的改变有关, 通过NBT染色来观察叶片中超氧化物自由基(O2–)的水平。正常情况下株系与Col-0叶片中NBT染色后的颜色无显著差异。在200 mmol L–1NaCl处理下,株系积累了更多的O2–, 叶片呈现出浓厚的深蓝色(图4-D); 同时, 本研究测定了株系和Col-0的内源H2O2水平。在盐胁迫下,株系比Col-0积累了更多的H2O2(图4-E)。表明, 在拟南芥中过表达可诱导盐胁迫下植株ROS的积累。此外, 本研究分析了株系和Col-0在正常和胁迫条件下的SOD、POD和CAT酶活。在正常条件下,株系与Col-0相比无明显差异, 而盐胁迫处理后,株系中SOD、POD和CAT酶活显著低于Col-0 (图4-F～H)。

A:基因在转基因拟南芥中的表达量分析。B～C:在盐胁迫下的萌发率。D: NBT染色。E: 测定不同基因型植物离体叶片中H2O2的积累。F～H: 盐胁迫处理后过表达系和WT的POD、SOD、CAT活性。I:过表达系(OE3和OE6)和WT在干旱胁迫下的表型。J: 干旱胁迫后过表达系(OE3和OE6)和WT的存活率。K:过表达系(OE3和OE6)和WT离体叶片失水率。*表示在0.05概率水平差异显著。

A: the relative expression analysis ofgene in transgenicplants by qRT-PCR. B–C: the germination of WT andoverexpression lines with different concentrations NaCl. D: NBT staining. E: measurement of accumulation of H2O2in detached leaves of plants with different genotypes. F–H: POD, SOD, and CAT activities ofoverexpression lines and WT after salt treatment. I: phenotypes ofoverexpression lines (OE3 and OE6) and WT under drought stress treatment. J: the survival rates ofoverexpression lines and WT after the drought stress. K: water loss rates of detached leaves fromoverexpression lines and WT. * means significant difference at the 0.05 probability level.

本研究对过表达株系及Col-0进行干旱胁迫处理。7 d后,和植株因缺水表现出严重的叶片干枯表型, 而Col-0植株未观察到明显的萎蔫症状(图4-I)。复水3 d后, 过表达植株几乎全部死亡, 而WT植株的存活率接近100% (图4-J)。同时, 对过表达株系及Col-0进行了离体叶片失水率测定发现,株系离体叶片失水率显著高于WT (图4-K)。表明, 过表达降低了拟南芥植株的抗旱性。

2.5 胁迫应答基因在敲除及过表达植株中表达量分析

敲除株系以及K326植株中胁迫相关基因、、、、表达量见图5。胁迫处理后、、、、基因表达量均明显升高, 且2个敲除株系中这些基因的表达量均显著高于K326, 表明基因敲除后的烟草株系能够通过提高抗性相关基因的表达量来响应逆境胁迫。

株系以及Col-0中胁迫相关基因、、、、表达量见图6。在胁迫处理下,和株系中、、、、基因表达量均显著低于Col-0。表明基因过表达能够抑制胁迫相关基因的转录水平进而导致植株的抗逆性显著降低。

3 讨论

干旱和盐胁迫会造成植物发育迟缓、抑制植物组织和器官的生长和分化, 使植物的发育进程提前[33]。NAC作为一类重要的转录因子, 在植物衰老及非生物胁迫应答中发挥着关键的调控作用[6]。先前的研究表明, 一些NAC转录因子成员作为调控衰老途径的关键因子在植物应激反应中发挥重要作用[34-35]。例如, 在拟南芥中过表达小麦可以增强转基因植株的耐盐性和耐旱性, 同时转基因植株表现出延迟衰老的表型[36]。拟南芥基因负向调节渗透胁迫的耐受性, 却正向调节叶片和果实的衰老[8,37]。有趣的是, 水稻的同源基因在叶片衰老和非生物胁迫响应(高盐和干旱)中都起正调控作用[38]。前期研究发现是叶片衰老的正向调控因子[24], 为探究该基因在调控衰老的同时是否对各种胁迫也有一定的响应, 本研究利用qRT-PCR对干旱盐和外源激素下的转录水平进行分析, 发现转录水平在干旱、高盐和外源ABA处理下快速上调, 暗示其参与衰老调控的同时还可能对其他多种非生物胁迫有应答。对烟草敲除株系以及拟南芥株系进行干旱胁迫时发现,敲除株系抗旱能力相对于K326显著增强, 而株系较Col-0相比则表现出对干旱十分敏感, 这与毛果杨基因在抗旱中功能相似[39]; 同时, 我们对基因敲除以及过表达株系进一步进行盐胁迫处理,敲除株系的抗盐能力较K326相比显著增强,拟南芥过表达株系抗盐能力较Col-0相比明显减弱, 这些结果表明, 烟草基因功能与拟南芥功能相似, 即在盐和干旱胁迫应答中起负向调控作用, 对植物叶片衰老起正向调控作用。

图5 干旱和盐胁迫应答基因在烟草敲除株系中的表达模式

*表示在0.05概率水平差异显著。* means significant difference at the 0.05 probability level.

(图6)

*表示在0.05概率水平差异显著。* means significant difference at the 0.05 probability level.

正常生长条件下, 植物体内的活性氧(ROS)能够被活性氧清除系统的各种酶(SOD、POD、CAT等)及时清除, 对细胞的正常活性不会有太大的影响[40]。但干旱和盐胁迫会使细胞内的活性氧水平迅速上升,破坏生物膜整体流动性、通透性和完整性, 导致细胞膜透性增大、细胞液外渗, 甚至导致细胞内膜系统的破坏及诱发细胞凋亡[41]。MDA作为一种脂质过氧化产物, 其含量高低代表着膜受损程度[42], 可溶性蛋白能够维持植物细胞结构相对完整, 功能稳定, 使细胞保持生物活性, 而脯氨酸作为一种渗透调节物质, 对细胞的渗透调节也起着关键作用[43]。在干旱和盐胁迫下,敲除株系SOD、CAT和POD酶活、可溶性蛋白和脯氨酸含量均显著高于K326, 而MDA含量显著低于K326, 同时利用NBT染色对过表达株系在盐胁迫下活性氧进行定性观察, 发现拟南芥过表达株系的染色颜色较深。表明不仅能够通过影响SOD、POD、CAT酶的活性来增强ROS清除能力, 还会通过影响可溶性蛋白及脯氨酸含量来维持细胞渗透平衡, 这与前人的研究结果一致, 即抗性较强的品种氧化损伤相对较小[44-45]。种子的萌发率是表征种子萌发水平和种子生活力的重要指标[46],株系在盐胁迫条件下的种子萌发率低于Col-0, 说明基因过表达会导致种子在盐胁迫萌发过程中细胞功能异常, 从而导致萌发率降低, 这与Jiang等[47]的研究结果一致, 表明基因的过表达可能会通过影响种子的萌发进而影响后期植株的抗逆性。

DREB类转录因子可以结合在DRE顺式作用元件上, 从而调节一些抗性相关基因的表达, 使植株的抗旱能力显著提高[48]。具有组织表达特异性, 属于植物内向钾离子通道基因, 在参与植物抗性调控中有重要作用[49]。及对Na+和K+的稳态至关重要, 可提高ROS清除能力, 维持膜完整性[50]。是乙烯响应因子(ERF)超家族的成员, 能够参与植物响应多种非生物胁迫的应答反应[51]。qRT-PCR结果表明,敲除会诱导这些抗性相关基因大量表达, 从而有利于提高烟草的抗性。这与闫筱筱等[52]的研究结果相似, 这表明能通过负调控相关抗性基因的表达来提高烟株抗旱及耐盐性。

4 结论

本试验对敲除株系进行盐胁迫和干旱胁迫处理发现,基因敲除后植株在耐盐及抗旱能力均有所提高, 对其生理数据进行测定发现SOD、POD、CAT酶的活性以及可溶性蛋白及脯氨酸含量均高于K326, MDA含量低于K326, 结果与表型相符合。同时在拟南芥中异源过表达, 发现植物的抗逆性明显减弱。因此,基因可能通过负调控抗氧化酶活性(SOD、POD、CAT)、MDA、可溶性蛋白和脯氨酸含量等生理生化反应以及胁迫相关基因表达进而提高植株的抗性。

[1] 张冠初, 张智猛, 慈敦伟, 丁红, 杨吉顺, 史晓龙, 田家明, 戴良香. 干旱和盐胁迫对花生渗透调节和抗氧化酶活性的影响. 华北农学报, 2018, 33(3): 176–181. Zhang G C, Zhang Z M, Ci D W, Ding H, Yang J S, Shi X L, Tian J M, Dai L X. Effects of drought and salt stress on osmotic regulator and antioxidaseactivities., 2018, 33(3): 176–181 (in Chinese with English abstract).

[2] Munns R, Tester M. Mechanisms of salinity tolerance., 2008, 59: 651–681.

[3] 王佳丽, 黄贤金, 钟太洋, 陈志刚. 盐碱地可持续利用研究综述. 地理学报, 2011, 66: 673–684. Wang J L, Huang X J, Zhong T Y, Chen Z G. Review on sustainable utilization of salt-affected land., 2011, 66: 673–684 (in Chinese with English abstract).

[4] 陈鑫, 马超, 杨永娟, 王红玲, 黄盈, 张晓霞, 黄开封, 赵卓, 张素芝. 转碱蓬基因烟草的耐盐抗旱性研究. 中国生态农业学报, 2017, 25: 1518–1526. Chen X, Ma C, Yang Y J, Wang H L, Huang Y, Zhang X X, Huang K F, Zhao Z, Zhang S Z. Overexpression ofgene enhanced salt and drought tolerance of transgenic tobacco., 2017, 25: 1518–1526 (in Chinese with English abstract).

[5] Suzuki N, Koussevitzky S, Mittler R, Miller G. ROS and redox signalling in the response of plants to abiotic stress., 2012, 35: 259–270.

[6] 郭亚宁. NAC转录因子在陆地棉叶片衰老中的作用. 西北农林科技大学博士学位论文, 陕西杨凌, 2017. Guo Y N. The Function of NAC TFs in Leaf Senescence of Upland Cotton. PhD Dissertation of Northwest A&F University, Yangling, Shaanxi, China, 2017 (in Chinese with English abstract).

[7] Balazadeh S, Riano-Pachon D M, Mueller-Roeber B. Transcription factors regulating leaf senescence in., 2008, 10: 63–75.

[8] Guo Y F, Gan S S. AtNAP, a NAC family transcription factor, has an important role in leaf senescence., 2006, 46: 601–612.

[9] 朱冬梅, 贾媛, 崔继哲, 付畅. 植物对盐胁迫应答的转录因子及其生物学特性. 生物技术通报, 2010, (4): 16–21. Zhu D M, Jia Y, Cui J Z, Fu C. Plant transcription factors in response to salt stress and its biological characteristic., 2010, (4): 16–21 (in Chinese with English abstract).

[10] Kim S G, Lee S, Seo P J, Kim S K, Kim J K, Park C M. Genome-scale screening and molecular characterization of membrane-bound transcription factors inand rice., 2010, 95: 56–65.

[11] Hu H, Dai M, Yao J, Xiao B, Li X, Zhang Q, Xiong L. Overexpressing a NAM, ATAF, and CUC (NAC) transcription factor enhances drought resistance and salt tolerance in rice, 2006, 103: 12987–12992.

[12] Mao C, Ding W, Wu Y, Yu J, He X, Shou H, Wu P. Overexpression of a NAC-domain protein promotes shoot branching in rice., 2007, 176: 288–298.

[13] Jeong J S, Kim Y S, Redillas M C, Jang G, Jung H, Bang S W, Choi Y D, Ha S H, Reuzeau C, Kim J K.overexpression enlarges root diameter in rice plants leading to enhanced drought tolerance and increased grain yield in the field., 2013, 11: 101–114.

[14] Zhang X, Long Y, Huang J, Xia J.is involved in ABA response and salt tolerance in rice., 2020, 13: 1–13.

[15] 任瑞, 张喜凤, 胡文韬, 钟丽梅, 余潮, 刘金龙. 拟南芥基因突变体对高盐和渗透胁迫的响应. 基因组学与应用生物学, 2019, 38: 8. Ren R, Zhang X F, Hu W T, Zhong L M, Yu C, Liu J L. The response ofgene mutant to high salt and osmotic stress., 2019, 38: 8 (in Chinese with English abstract).

[16] Tran L P, Nakashima K, Sakuma Y, Simpson S D, Fujita Y, Maruyama K, Fujita M, Seki M, Shinozaki K, Yamaguchi-Shinozaki K. Isolation and functional analysis ofstress-inducible NAC transcription factors that bind to a drought-responsivein the early responsive to dehydration stress 1 promoter., 2004, 16: 2481–2498.

[17] Lee S, Lee H, Huh S U, Paek K, Ha J, Park C. TheNAC transcription factorparticipates in a positive feedback loop that induces programmed cell death under heat stress conditions., 2014, 227: 76–83.

[18] Mao X, Zhang H, Qian X, Li A, Zhao G, Jing R., a NAC-type wheat transcription factor conferring enhanced multiple abiotic stress tolerances in., 2012, 63: 2933–2946.

[19] Xue G, Way H M, Richardson T, Drenth J, Joyce P A, Mcintyre C L. Overexpression ofleads to enhanced transcript levels of stress up-regulated genes and dehydration tolerance in bread wheat., 2011, 4: 697–712.

[20] Zhu M, Chen G, Zhang J, Zhang Y, Xie Q, Zhao Z, Pan Y, Hu Z. The abiotic stress-responsive NAC-type transcription factorregulates salt and drought tolerance and stress-related genes in tomato ()., 2014, 33: 1851–1863.

[21] Ma N N, Zuo Y Q, Liang X Q, Yin B, Wang G D, Meng Q W. The multiple stress-responsive transcription factorimproves the chilling tolerance of tomato., 2013, 149: 474–486.

[22] Li X X, Wang Q, Guo C, Sun J, Li Z, Wang Y, Yang A, Pu W, Guo Y, Gao J., A novel NAC transcription factor, confers drought and salt tolerances in tobacco., 2022, 13: 817106–817106.

[23] Xu, X Y, Yao X Z, Lu L T, Zhao D G. Overexpression of the transcription factorconfers drought tolerance in tobacco., 2018, 36: 543–552.

[24] Li W, Li X X, Chao J T, Zhang Z L, Wang W F, Guo Y F. NAC family transcription factors in tobacco and their potential role in regulating leaf senescence., 2018, 9: 1900.

[25] 赵晓妮. 刺五加和龙牙楤木体胚发生及其有效物质累积研究. 东北林业大学硕士学位论文, 黑龙江哈尔滨, 2013. Zhao X N. Studies on Somatic Embryo Genesis and Effective Substances Accumulation ofand. MS Thesis of Northeast Forestry University, Harbin, Heilongjiang, China, 2013 (in Chinese with English abstract).

[26] 王群, 刘朝巍, 徐文娟. 紫外分光光度法测定玉米过氧化氢酶活性新进展. 中国农学通报, 2016, 32(15): 159–165. Wang Q, Liu C W, Xu W J. Ultraviolet spectrophotometry measurement of catalase activity in maize., 2016, 32(15): 159–165 (in Chinese with English abstract).

[27] 赵永斌, 盛雪, 肖丹, 林彤, 刘金阳. 山葡萄脯氨酸含量与温度的相关性. 榆林学院学报, 2012, 22(6): 10–13. Zhao Y B, Sheng X, Xiao D, Lin T, Liu J Y. On correlation between proline content of amur grape and environment temperature., 2012, 22(6): 10–13 (in Chinese with English abstract).

[28] 朱红芳, 李晓锋, 朱玉英, 郭欣欣, 刘金平, 高倩倩, 翟文. 根肿病对不结球白菜的生长及生理生化物质和活性氧代谢的影响. 西北植物学报, 2015, 35: 2469–2476. Zhu H F, Li X F, Zhu Y Y, Guo X X, Liu J P, Gao Q Q, Zhai W. Effects of clubroot disease on growth physiochemical substance and reactive oxygen metabolism in pak-choi., 2015, 35: 2469–2476 (in Chinese with English abstract).

[29] Yasuhiro K, Ken S, Cyril Z. Regulation of the NADPH oxidase RBOHD during plant immunity., 2015, 56: 1472–1480.

[30] 杨盛昌, 谢潮添, 张平, 陈德海, 丁印龙, 廖启炓. 低温胁迫下弓葵幼苗膜脂过氧化及保护酶活性的变化. 园艺学报, 2003, 30(1): 104–106. Yang S C, Xie C T, Zhang P, Chen D H, Ding Y L, Liao Q L. Changes in membrane lipid peroxidation and activities of cell defense enzyme in leave es ofBecc. seedling under low temperature stress., 2003, 30(1): 104–106 (in Chinese with English abstract).

[31] 任伟, 高慧娟, 王润娟, 吕昕培, 何傲蕾, 邵坤仲, 汪永平, 张金林. 高等植物适应干旱生境研究进展. 草学, 2020, (3): 4–15.Ren W, Gao H J, Wang R J, Lyu X P, He A L, Shao K Z, Wang Y P, Zhang J L. Research advances in adaptation of higher plants to arid habitats., 2020, (3): 4–15 (in Chinese with English abstract).

[32] 李志, 薛姣, 耿贵, 王宇光, 於丽华. 逆境胁迫下甜菜生理特性的研究进展. 中国农学通报, 2021, 37(24): 39–47. Li Z, Xue J, Geng G, Wang Y G, Yu L H. The physiological characteristics of beets under stress., 2021, 37(24): 39–47 (in Chinese with English abstract).

[33] 杨少辉, 季静, 王罡. 盐胁迫对植物的影响及植物的抗盐机理.世界科技研究与发展, 2006, 28(4): 70–76. Yang S H, Ji J, Wang G. Effects of salt stress on plants and the mechanism of salt tolerance., 2006, 28(4): 70–76 (in Chinese with English abstract).

[34] Guo Y F, Gan S S. Convergence and divergence in gene expression profiles induced by leaf senescence and 27 senescence-promoting hormonal, pathological and environmental stress treatments., 2012, 35: 644–655.

[35] Zhang K, Gan S S. An abscisic acid-transcription factor-SAG113 protein phosphatase 2C regulatory chain for controlling dehydration in senescingleaves., 2012, 158: 961–969.

[36] Huang Q J, Wang Y, Li B, Chang J L, Chen M J, Li K X , Yang G X, He G Y. TaNAC29, a NAC transcription factor from wheat, enhances salt and drought tolerance in transgenic., 2015, 15: 268.

[37] Kou X H, Watkins C B, Gan S S.regulates fruit senescence., 2012, 63: 6139–6147.

[38] Liang C, Wang Y, Zhu Y, Tang J, Hu B, Liu L, Ou S, Wu H, Sun X, Chu J.connects abscisic acid and leaf senescence by fine-tuning abscisic acid biosynthesis and directly targeting senescence-associated genes in rice., 2014, 111: 10013.

[39] 杨洁. 毛果杨PtNAC101基因在高盐胁迫中的功能分析. 鲁东大学硕士学位论文, 山东烟台, 2021. Yang J. The Functional Analysis ofGene inunder High Salt Stress. MS Thesis of Ludong University, Yantai, Shandong, China, 2021 (in Chinese with English abstract).

[40] 林少华, 张晓军, 张慧杰, 贾红亮, 潘妍, 罗红霞. 果蔬氧化还原防御系统研究进展. 中国果菜, 2021, 41(4): 33–39. Lin S H, Zhang X J, Zhang H J, Jia H L, Pan Y, Luo H X. Research progress on redox defense system of fruits and vegetables., 2021, 41(4): 33–39 (in Chinese with English abstract).

[41] 王晓娟. 干旱胁迫对红花檵木生长和生理特性的影响. 四川农业大学硕士学位论文, 四川成都, 2015. Wang X J. Growth and Physiological Characteristics ofunder Drought Stress. MS Thesis of Sichuan Agricultural University, Chengdu, Sichuan, China, 2015 (in Chinese with English abstract).

[42] Guo R, Zhao J, Wang X, Guo C, Li Z, Wang Y, Wang X. Constitutive expression of a grape aspartic protease gene in transgenicconfers osmotic stress tolerance., 2015, 121: 275–287.

[43] Boudmyxay K, 沈镭, 钟帅, 孙艳芝, 杨慧芹. 脯氨酸引发提高烟草种子和幼苗抗逆性及其与抗氧化系统的关系. 山西农业科学, 2019, 47(1): 39–48. Boudmyxay K, Shen L, Zhong S, Sun Y Z, Yang H Q. Improving the antioxidant system and its stress resistance to tobacco seeds and seedling by proline priming., 2019, 47(1): 39–48 (in Chinese with English abstract).

[44] 黄建. 农杆菌介导基因转化枣树(Mill.)的研究. 西北农林科技大学硕士学位论文, 陕西杨凌, 2006. Huang J. Study on-mediated Transformation ofwithGene. MS Thesis of Northwest A&F University, Yangling, Shaanxi, China, 2006 (in Chinese with English abstract).

[45] 韩佩尧, 赵烨, 田彦挺, 侯荣轩, 孙宇涵, 李云. 植物耐盐机制及耐盐基因在杨树育种中的应用. 分子植物育种, 2021, 19: 7977–7983. Han P Y, Zhao Y, Tian Y T, Hou R X, Sun Y H, Li Y. Mechanism of plant salt tolerance and application of salt tolerance gene in poplar breeding., 2021, 19: 7977–7983 (in Chinese with English abstract).

[46] 钟磊, 钱家萍, 蔡启忠, 王敏, 张慧晔, 杨全, 罗碧. 肉桂种子生物学特性及生活力研究. 种子, 2021, 40(7): 99–103.Zhong L, Qian J P, Cai Q Z, Wang M, Zhang H Y, Yang Q, Luo B. Study on biological characteristics and viability ofseeds., 2021, 40(7): 99–103 (in Chinese with English abstract).

[47] Jiang D, Zhou L, Chen W, Ye N, Xia J, Zhuang C. Overexpression of a microRNA-targeted NAC transcription factor improves drought and salt tolerance in riceABA-mediated pathways., 2019, 12: 76.

[48] 马丽. 梭梭再生体系研究及基因的克隆与分析. 新疆农业大学硕士学位论文, 新疆乌鲁木齐, 2017. Ma L. Cloning and Analyzing ofand the Establishing on Regeneration System of. MS Thesis of Xinjiang Agricultural University, Urumqi, Xinjiang, China, 2017 (in Chinese with English abstract).

[49] Caroline S, Aleksandra W, Florina V, Christiane V, Jeffrey L. Guard cell as a single-cell model towards understanding drought tolerance and abscisic acid action., 2009, 60: 1439–1463.

[50] Zhang W D, Wang P, Bao Z L, Ma Q, Duan L J, Bao A K, Zhang J L, Wang S M. SOS1, HKT1, and NHX1 synergistically modulate Na+homeostasis in the halophytic grass., 2017, 8: 576.

[51] Pan Y, Seymour G B, Lu C, Hu Z, Chen X, Chen G. An ethylene response factor (ERF5) promoting adaptation to drought and salt tolerance in tomato., 2012, 31: 349–360.

[52] 关扬扬, 郑淑心, 刘向阳, 王召军, 张洪映, 崔红, 闫筱筱.基因表达对烟草抗旱性的影响. 烟草科技, 2021, 54(3): 1–8. Guan Y Y, Zheng S X, Liu X Y, Wang Z J, Zhang H Y, Cui H, Yan X X. Effect ofgene expression on drought resistance of tobacco., 2021, 54(3): 1–8 (in Chinese with English abstract).

Expression and functional characterization oftranscription factor gene fromunder abiotic stress

WEN Li-Chao1,2, XIONG Tao3, DENG Zhi-Chao1,2, LIU Tao1,2, GUO Cun4, LI Wei1,*, and GUO Yong-Feng1,*

1Tobacco Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Qingdao 266101, Shandong, China;2Graduate School of Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China;3Enshi Tobacco Company, Enshi 445000, Hubei, China;4Kunming Tobacco Company, Kunming 650000, Yunnan, China

NAC proteins, which constitute one of the largest plant-specific transcription factor families, are widely involved in the regulation of plant development, senescence and stress responses. To explore the function ofin abiotic stress response, qRT-PCR was used to analyze the relative expression pattern ofgenesunder different abiotic stress treatments. Results showed that the relative expression level ofgenes was induced by drought, salt, ABA, MeJA, and SA treatments. Themutant and WT (K326) plants were used to analyze the phenotypes under salt and drought stresses. Results showed thatknockout tobacco lines had increased tolerance to salt and drought stresses. Under salt and drought stresses treatments, the antioxidant enzymes (SOD, POD, and CAT) activities, soluble protein, and proline contents of these two knockout lines plants were significantly higher than those of WT, while MDA content was significantly lower than that of WT. In contrast,-overexpressingplants had more sensitive to salt and drought stresses. Furthermore,mutation in tobacco resulted in the up-regulated expression of abiotic stress-related genes (,, and) after salt and drought treatments. These results indicated thatcould be play a negative role in response to salt and drought stresses by regulating the activity of antioxidant enzymes and the relative expression level of stress-related genes.

tobacco;; ROS; the relative expression analysis; abiotic stresses

2023-02-10;

2023-02-28.

10.3724/SP.J.1006.2023.24193

通信作者(Corresponding authors):李伟, E-mail: liwei06@caas.cn;郭永峰, E-mail: guoyongfeng@caas.cn.

E-mail: 82101201624@caas.cn

2022-08-23;

本研究由国家自然科学基金项目(31400267, 31970204)和中国农业科学院科技创新工程项目(ASTIP-TRIC02)资助。

This study was supported by the National Natural Science Foundation of China (31400267, 31970204) and the Agricultural Science and Technology Innovation Program (ASTIP-TRIC02).

URL: https://kns.cnki.net/kcms/detail//11.1809.S.20230227.1346.004.html

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