转化生长因子β1对膀胱癌细胞增殖与迁移能力的影响及其机制

陈鑫磊 余永波 李鹏 牛海涛

(青岛大学附属医院泌尿外科,山东 青岛 266003)

膀胱癌是泌尿系统常见的恶性肿瘤之一,近年其发病率和死亡率呈现逐年增高的趋势［1-2］。随着近年来医学技术不断发展,肿瘤免疫治疗已取得一定成效,为膀胱癌的治疗提供了新思路。转化生长因子β1(TGF-β1)是一种多功能生长抑制因子,其在肿瘤早期能够促进正常细胞的分化并且能够抑制肿瘤细胞增殖,而在肿瘤晚期,TGF-β1则通过促进上皮-间充质转化(EMT)、刺激血管生成、诱导免疫抑制与肿瘤微环境形成等过程,发挥促进肿瘤进展的作用［3-4］。PD-L1是一种免疫检查点关键蛋白,与T细胞上的程序性死亡配体1(PD-1)结合,导致肿瘤免疫抑制［5］。目前关于TGF-β1与膀胱癌相关性的研究并不多,本研究旨在探讨TGF-β1对膀胱癌T24细胞增殖、迁移能力的影响及其可能的作用机制。

1 材料和方法

1.1 细胞与试剂

膀胱癌细胞T24细胞系购买于中国科学院上海生物研究所细胞资源中心;TGF-β1、SB431542、MK2206、U0126购自美国MedChemExpress公司;Ecl显影试剂购自美国Millipore公司;PD-L1、磷酸化的丝苏氨酸蛋白激酶(p-AKT)、磷酸化的细胞外调节激酶(p-ERK)蛋白、α肌动蛋白(α-ACTIN)抗体购自美国CST公司;二抗购自美国Jackson ImmunoResearch公司。

1.2 细胞培养

人膀胱癌细胞系T24细胞在37 ℃、含体积分数0.05 CO2条件下,在RPMI1640培养基(含体积分数0.10胎牛血清、1×108U/L链霉素和100 g/L青霉素)中进行培养,当细胞密度到达80%以上,使用胰蛋白酶进行消化,使贴壁的T24细胞悬浮,加入胎牛血清终止胰蛋白酶消化,以1 000 r/min离心5 min后重悬,细胞计数后进行后续实验。

1.3 MTT法检测TGF-β1对T24细胞的增殖能力的影响

取对数生长期的T24细胞均匀接种于96孔板(5 000个/孔)内,继续培养8 h待T24细胞贴壁后;加入终浓度为0、1、5、10、20、40 μg/L的TGF-β1继续培养24 h后,每种浓度分别设置5个复孔;加入20 μL MTT溶液(5 g/L)4 h后,弃上清液;每孔加150 μL二甲基亚砜,摇床上低速振荡10 min,以酶联免疫检测仪检测波长490 nm处各孔吸光度值。

1.4 细胞划痕实验检测TGF-β1对T24细胞迁移能力的影响

取对数生长期的T24细胞均匀接种于12孔板(25 000个/孔)内培养,待细胞密度大于90%后弃上清液,PBS清洗后,更换为无血清的RPMI 1640培养液培养,加入0、1、5、10、20、40 μg/L的TGF-β1培养24 h后,使用倒置显微镜4倍视野下观察细胞划痕愈合情况。

1.5 Western blot方法检测TGF-β1对于T24细胞PD-L1蛋白表达影响

按照1.4方法以终浓度0、1、5、10、20、40 μg/L的TGF-β1处理T24细胞24 h,提取细胞中的总蛋白;将对数生长期的T24细胞分为A～C组,A组使用正常培养基培养,B组培养基中加入终浓度为5 μg/L的TGF-β1培养,C组培养基中加入终浓度为5 μg/L的TGF-β1以及SB431542培养,均处理24 h后,提取细胞总蛋白。分别对以上蛋白进行聚丙烯酰胺凝胶上电泳,PVDF转膜,然后封闭0.5 h,使用PD-L1蛋白单克隆抗体进行孵育过夜后,以α-ACTIN为内参照,TBST洗膜3次,二抗室温孵育2 h,TBST洗膜3次,ECL显影液显影,拍照并保存,使用Image J软件对成像进行灰度值分析。

1.6 Western blot方法检测TGF-β1对T24细胞中p-ERK、p-AKT、PD-L1蛋白表达的影响

按1.4方法以质量浓度5 μg/L的TGF-β1处理T24细胞0、0.5、1、2、6、24 h后,提取细胞中总蛋白;将对数生长期的膀胱癌T24细胞分为D～G组,D组使用正常培养基培养,E组培养基中加入终浓度为5 μg/L的TGF-β1培养,F组培养基中加入终浓度为5 μg/L的TGF-β1、AKT抑制剂MK2206培养,G组培养基中加入终浓度5 μg/L的TGF-β1、ERK抑制剂U0126处理T24细胞,均培养24 h以后提取总蛋白;分别对以上蛋白进行Western blot方法检测,以α-actin作为内参照,检测p-ERK、p-AKT以及PD-L1蛋白的表达情况。

1.7 统计学分析

2 结 果

2.1 不同浓度TGF-β1对T24细胞增殖能力影响

以浓度0、1、5、10、20、40 μg/L的TGF-β1处理T24细胞的吸光度值分别为0.92±0.02、1.02±0.02、1.18±0.06、1.23±0.03、1.24±0.06、1.16±0.02。各浓度间T24细胞的增殖能力比较差异具有显著性(F=48.30,P<0.05),其他浓度的TGF-β1处理T24细胞的增殖能力相较于0 μg/L时均显著增强(t=3.59～12.18,P<0.05)。

2.2 不同浓度TGF-β1对T24细胞迁移能力影响

浓度0、1、5、10、20、40 μg/L的TGF-β1处理T24细胞的迁移率分别为0.19±0.01、0.18±0.01、0.20±0.01、0.21±0.01、0.24±0.01、0.19±0.01,各浓度间比较,T24细胞的迁移率没有显著差异(P>0.05)。见图1。

图1 不同浓度的TGF-β1对T24细胞迁移能力的影响

2.3 各处理组T24细胞中PD-L1表达情况比较

以浓度0、1、5、10、20、40 μg/L的TGF-β1处理T24细胞24 h后,T24细胞中PD-L1的表达量分别为0.84±0.17、1.21±0.16、1.53±0.18、1.06±0.12、1.09±0.12、1.14±0.11。各浓度间比较,T24细胞的PD-L1表达量差异均具有显著性(F=6.83,P<0.05),在TGF-β1浓度为5 μg/L时相较于其他浓度,差异具有显著性(t=3.22～5.64,P<0.05)。浓度为5 μg/L的TGF-β1处理T24细胞0、0.5、1、2、6、24 h后,PD-L1的相对表达量分别为0.41±0.04、0.51±0.01、0.57±0.01、0.68±0.02、0.76±0.02、1.09±0.02。不同处理时间比较,T24细胞PD-L1表达量均有显著差异,且随时间延长逐渐升高(F=199.20,P<0.05)。

A～C组T24细胞中PD-L1蛋白的相对表达量分别为0.67±0.02、1.07±0.01、0.85±0.03,三组间比较差异具有显著性(F=244.60,P<0.05),其中B组与A组比较,T24细胞PD-L1蛋白表达量显著升高(t=31.24,P<0.05),C组与B组比较,T24细胞PD-L1蛋白表达量降低(t=17.04,P<0.05)。

D～G组T24细胞中PD-L1蛋白的相对表达量分别为0.65±0.03、1.01±0.03、0.76±0.02、0.86±0.01,4组间比较差异具有显著的意义(F=115.20,P<0.05),其中E组与D组比较,T24细胞PD-L1表达量显著升高(t=25.37,P<0.05),F、G组与E组比较,细胞PD-L1蛋白表达量均显著降低(t=17.01、6.74,P<0.05)。

2.4 各处理组T24细胞中p-AKT、p-ERK的表达情况比较

以浓度为5 μg/L的TGF-β1处理T24细胞0、0.5、1、2、6、24 h后,细胞中p-AKT的相对表达量分别为0.34±0.02、1.18±0.02、0.94±0.01、0.84±0.03、0.37±0.02、0.14±0.02,p-ERK的相对表达量分别为0.34±0.02、1.11±0.02、0.96±0.02、0.86±0.01、0.66±0.02、0.64±0.06。各处理时间相比较,p-AKT及p-ERK表达量均具有显著性差异(F=1 267.00、252.00,P<0.05),其中加入5 μg/L的TGF-β1 处理T24细胞0.5 h时,相较于其他处理时间,p-AKT、p-ERK表达量均显著升高(t=6.26～64.24,P<0.05)。

D～G组T24细胞中p-AKT蛋白的相对表达量分别为0.63±0.02、0.94±0.02、0.99±0.01、0.07±0.01,p-ERK蛋白的相对表达量分别为0.80±0.02、0.93±0.03、0.60±0.01、1.20±0.03,4组间比较,T24细胞中p-AKT、p-ERK蛋白的相对表达量差异均具有显著性(F=2 577.00、338.40,P<0.05);E组与D组比较,T24细胞中p-AKT、p-ERK表达显著升高(t=37.29、9.44,P<0.05);G组与E组比较,T24细胞中p-AKT蛋白表达显著性降低(t=104.40,P<0.05);F组与E组相比较,T24细胞中p-ERK蛋白表达显著降低(t=24.26,P<0.05)。

3 讨 论

TGF-β作为一种免疫抑制因子,在促进肿瘤转移和抵抗治疗中发挥了重要作用［6］。TGF-β是体内许多细胞可以分泌的具有多种功能的多肽,其可以影响细胞的生长、分化、黏附、迁移和凋亡等［7］。TGF-β在肿瘤的形成与发展中发挥两种不同的调节作用,在肿瘤形成阶段,TGF-β维持免疫自耐受性,并通过调节上皮增殖、凋亡和分化来抑制肿瘤进展［8-9］,而随着肿瘤的不断发展,TGF-β的激活和信号传导发生异常,导致其刺激肿瘤微环境(TME)内的血管生成、EMT、肿瘤成纤维细胞活化以及免疫抑制来促进疾病进展［10-12］。TME当中TGF-β的高表达与临床结局差以及肿瘤转移的可能性增高相关［13-14］,并且有研究表明在膀胱癌中,TGF-β1的高表达与患者的预后不良相关［15］。本研究结果显示,TGF-β可以促进膀胱癌T24细胞的增殖,但对T24细胞的迁移无显著影响。

已有研究表明TGF-β1与PD-L1之间存在相关机制和功能联系［16］。PD-1/PD-L1检查点抑制剂可以特异性抑制PD-1和PD-L1的结合,激活T细胞活性发挥对肿瘤的杀伤作用［5］。在肿瘤患者中,肿瘤细胞的PD-L1与T细胞表面的PD-1结合以后,T细胞不能识别并清除肿瘤细胞,从而促使肿瘤逃避了机体的免疫系统,导致肿瘤细胞发生免疫逃逸［17］,已有研究发现敲除小鼠的TGF-β基因会引起严重的自身免疫性疾病［18］。PD-1对机体调节具有双重作用,一方面其可以避免无效或者有害的免疫应答,并与免疫耐受有关,另一方面,它可以通过阻碍保护性免疫导致肿瘤细胞的快速增长［19］。PD-L1是PD-1的配体,通常在炎症时由部分免疫细胞和上皮细胞表达,但其在肿瘤中表达则是肿瘤细胞的“自适应免疫制剂”,发挥抗肿瘤作用［20］。

本研究通过使用1、5、10、20、40 μg/L浓度的TGF-β1处理膀胱癌T24细胞,结果示各个浓度的TGF-β1均提高了细胞中PD-L1蛋白的表达水平。随后,在5 μg/L浓度的TGF-β1处理0、0.5、1、2、6、24 h时,观察到PD-L1随时间延长表达水平显著升高。为进一步研究PD-L1的表达水平与TGF-β1的关系,同时又使用了TGF-β1与TGF-β1抑制剂SB4311542进行处理,发现比单独使用TGF-β1处理,其促进PD-L1表达的效果受到抑制,说明TGF-β1能够促进T24细胞PD-L1蛋白的表达。为了研究TGF-β1促进T24细胞PD-L1蛋白的表达是否与p-ERK、p-AKT有关,本研究使用浓度5 μg/L的TGF-β1处理T24细胞,检测T24细胞中p-ERK、p-AKT蛋白的水平,发现在0.5 h时p-ERK、p-AKT蛋白表达已经显著升高;为了进一步证实这个观点,本研究又分别使用AKT抑制剂MK2206和ERK抑制剂U0126对T24细胞进行处理以后,发现抑制p-ERK、p-AKT表达后,TGF-β1促进T24细胞中PD-L1表达水平的能力受到抑制,可见TGF-β1可能是通过ERK、AKT通路提高T24细胞PD-L1的表达。在对乳腺癌和肝癌研究中发现,PD-L1与TGF-β1表达显著正相关,阻断TGF-β后,PD-L1表达水平显著降低［21-22］。由此可以认为TGF-β1是通过促进膀胱癌T24细胞中PD-L1表达,进而促进肿瘤细胞生长和发展,但具体机制仍需进一步研究。

综上所述,TGF-β1可以促进膀胱癌T24细胞的增殖,不影响其迁移,TGF-β1可能是通过促进细胞内PD-L1、p-ERK和p-AKT的表达促进肿瘤的生长和发展。

作者声明：陈鑫磊、余永波、李鹏、牛海涛参与了研究设计;陈鑫磊、牛海涛参与了论文的写作和修改。所有作者均阅读并同意发表该论文。所有作者均声明不存在利益冲突。