缺氧肝癌源性外泌体miR-1260b对肿瘤相关巨噬细胞M2亚型的影响及其机制

杨晔妮 赵梓吟 王有鹏 孙洪发 张顺 韩冰

(青岛大学附属医院,山东 青岛 266003 1 肝胆胰外科;2 器官移植中心)

肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)的发病率在全球人群中位居第6位［1］,确诊时间晚、高复发率和高死亡率是造成HCC患者不良预后的重要原因。研究显示瘤内缺氧是进展期HCC的关键特征,缺氧除可通过调节缺氧诱导因子(HIF)引起肝癌细胞适应性缺氧等的一系列变化,还具有影响肿瘤细胞分泌的外泌体对免疫细胞中的巨噬细胞传递信号的作用［2-3］。

外泌体是一类粒径30～150 nm的含有RNA和蛋白的盘状囊泡,可在不同类型细胞之间起通讯作用［4］。研究发现,外泌体中膜蛋白凋亡诱导因子6相互作用蛋白(Alix)高表达,而基本不表达钙连接蛋白。缺氧环境可以影响肝癌细胞分泌和传递外泌体,从而影响肿瘤细胞与肿瘤微环境中其他细胞,包括肿瘤相关巨噬细胞(TAM)的通讯［5-7］。

本课题组先前的实验发现,SOCS5可以调节HIF-1α依赖性的线粒体损伤,进一步促进HCC的进展［3］。但是在缺氧环境下,肝癌细胞是如何通过外泌体转运核酸物质到达巨噬细胞,以及诱导免疫抑制的具体机制目前尚不清楚。本研究通过构建人HCC97H(MHCC97H)细胞缺氧模型,探讨缺氧肝癌细胞源性外泌体miR-1260b对巨噬细胞M2亚型的影响及其机制,旨在为HCC的免疫治疗提供新的治疗靶点。

1 材料和方法

1.1 材料与试剂

MHCC97H细胞和人单核白血病细胞(THP-1)均购自中国科学院上海生命科学研究院,并通过短串联重复序列(STR)分析验证了细胞的真实性;2.5 g/L胰蛋白酶溶液、高效RIPA裂解液、蛋白酶抑制剂混合液、蛋白磷酸酶抑制剂混合物购自北京索莱宝科技有限公司,TRIzol购自美国Invitrogen公司。

1.2 研究方法

1.2.1细胞培养和处理 97H细胞置于完全培养基(含体积分数0.10的胎牛血清、100 kU/L青霉素和100 mg/L链霉素的高糖DMEM)中,在37 ℃、含体积分数0.05的CO2培养箱当中进行培养。待97H细胞融合度达70%～80%后,在完全培养基中分别加入0、100 μmol/L浓度的CoCl2,培养24 h后提取RNA,实时荧光定量PCR方法(RT-qPCR)方法检测细胞中HIF-1α的相对表达量,若HIF-1α稳定高表达且两种浓度间有显著差异时,则为细胞缺氧模型构建成功［8-9］,可用于后续实验。

将THP-1细胞置于THP-1专用培养基(武汉普诺赛生命科技有限公司)中,和97H细胞相同条件进行培养,培养至对数生长期以后进行实验。取THP-1细胞计数并接种于含有专用培养基的6孔板中,每孔约1×106个细胞,分别向专用培养基中加入浓度0、100 μg/L的丙二醇甲醚醋酸酯(PMA)(美国MedChemExpress生物科技有限公司),分别为THP-1组和THP-1+PMA组,继续培养24 h,然后使用RT-qPCR方法检测两组THP-1细胞中CD11b相对表达量,此时在THP-1+PMA组中得到的细胞即为M0巨噬细胞。然后于培养了24 h的THP-1+PMA组培养基中再加入100 μg/L的IL-4/IL-13,继续培养72 h以后,得到M2巨噬细胞(M2组)［10］。

1.2.2细胞共培养 将M0巨噬细胞铺至孔径为0.4 μm的共培养板的上室内,分别将融合度达到70%～80%的97H细胞,以及细胞缺氧模型构建成功97H细胞铺至共培养板的下室,分别为97H-N+M0组和97H-H+M0组,共培养48 h以后,采用RT-qPCR方法检测上述两组以及M2组巨噬细胞中TNF-α、CD163和CD206的相对表达量。

将M0巨噬细胞铺至孔径为0.4 μm的共培养板上室内,待97H细胞融合度达70%～80%时,分别转染miR-1260b NC(97H-NC+M0组)和miR-1260b Mimic(97H-Mimic+M0组),并将其铺至共培养板下室,共培养48 h,采用RT-qPCR方法检测两组细胞中TNF-α和CD206相对表达量。

将融合度达到70%～80%的97H细胞转染miR-1260b Inhibitor后,再加入100 μmol/L浓度的CoCl2缺氧处理24 h,即为97H-H-1260 IN组细胞。将M0巨噬细胞铺至孔径为0.4 μm的共培养板上室内,将上面获得的97H-H-1260 IN组细胞(97H-H-1260 IN+M0组)以及融合度达到70%～80%的97H细胞(97H-N+M0组)和细胞缺氧模型构建成功97H细胞(97H-H+M0组)铺至共培养板下室,继续培养48 h,RT-qPCR方法检测上述4组M0巨噬细胞中TNF-α和CD206相对表达量。

1.3 外泌体的提取、鉴定及示踪

将97H细胞置于完全培养基中,待细胞融合度达到70%～80%时,分别向完全培养基中加入0、100 μmol/L的CoCl2,培养24 h后,将培养基更换为DMEM培养基(含体积分数0.10无外泌体胎牛血清),分别为exo-N组和exo-H组,培养48 h后,采用低温差速离心方法［11］提取exo-N组和exo-H组细胞上清液中的外泌体,并重悬于50～100 μL的PBS中。

取浓度为100 g/L的exo-N组外泌体颗粒,以Dil橙红色荧光染料进行标记。加至没有染料标记的M0巨噬细胞培养基中,共同孵育24 h后,利用荧光显微镜观察M0巨噬细胞内的荧光反应,若外泌体被巨噬细胞吞噬则出现橙红色荧光颗粒。

取exo-N组和exo-H组的20 μL的外泌体颗粒悬液滴至电镜铜网栅中,停留1 min,磷钨酸溶液负染固定1～10 min,滤纸吸干后室温自然晾干,在生物透射电子显微镜下观察外泌体的大小和形状,并拍照。使用纳米颗粒跟踪分析仪(NTA)的ZetaVIEW S/N 252软件分析外泌体颗粒的大小。

取exo-N组和exo-H组外泌体颗粒,设置浓度100 g/L,加至M0细胞培养基中,分别为exo-N+M0组和exo-H+M0组,培养48 h以后,通过RT-qPCR方法检测两组细胞中CD206相对表达量。

1.4 细胞转染

参考文献［12］的方法,向M0巨噬细胞内转染miR-1260b NC、miR-1260b Mimic、miR-1260b NC-Inhibitor、miR-1260b Inhibitor,分别为M0-NC组、M0-Mimic组、M0-NC IN组、M0-IN组,向M2巨噬细胞转染miR-1260b NC、miR-1260b Inhibitor,分别为M2-NC IN组和M2-IN组。采用RT-qPCR方法检测以上各组巨噬细胞中TNF-α以及CD206的表达。miR-1260b NC引物的序列为：5′-UUCU-CCGAACGUGUCACGUTT-3′;miR-1260b Mimic引物的序列为：5′-AUCCCACCACUGCCACCAU-GGUGGCAGUGGUGGGAUUU-3。miR-1260b NC-Inhibitor引物的序列为：5′-CAGUACUUUUGUG-UAGUACAA-3′;miR-1260b Inhibitor引物的序列为：5′-AUGGUGGCAGUGGUGGGAU-3′。

1.5 RT-qPCR方法检测外泌体中miR-1260b相对表达量

按照试剂盒说明书的要求,用TRIzol试剂提取exo-N组和exo-H组外泌体颗粒中的RNA,利用Nano Drop分光光度计检测提取的RNA浓度以及纯度,用TaKaRa(日本宝日医生物技术有限公司)的SYBR®Premix Ex Taq TM Ⅱ进行RT-qPCR。PCR反应体系共20 μL,包括10 μL的PCR Master Mix、1 μg cDNA以及适宜浓度的DEPC水和引物。以U6为内参。引物委托由上海生工生物工程有限公司合成,miR-1260b的特异性引物为：5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACT-GGATACGACAAAATA-3′,正向引物为：5′-CG-CGATCCCACCACTGC-3′,反向引物为：5′-AGTGCAGGGTCCGAGGTATT-3′;U6的特异性引物为：5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGA-GGTATTCGCACTGGATACGACAAAATA-3′,正向引物为：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′,反向引物为：5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。

1.6 Western blot方法检测97H细胞和外泌体中Alix和钙连接蛋白的表达水平

97H细胞融合度达到70%～80%时,使用RIPA裂解液、蛋白酶和磷酸酶抑制剂裂解97H细胞(97H组),提取蛋白混合物。对新鲜提取的exo-N组和exo-H组的外泌体颗粒同时使用上述试剂进行裂解,提取蛋白混合物。采用BCA-蛋白定量法对样品中的蛋白进行定量以后,使用SDS-PAGE凝胶分离蛋白,利用电场装置将分离的蛋白转移至PVDF膜上,严格膜封闭后,一抗4 ℃下孵育过夜。与同种酶偶联的山羊抗兔IgG-HRP(上海爱必信生物科技有限公司)抗体结合后,加入ECL发光溶液显色后,采用成像仪检测目标蛋白的相对表达量。所用的抗体有抗-Alix、抗-Calnexin(1∶1 000,上海艾博抗贸易有限公司)、抗-GAPDH(1∶1 000,上海爱必信生物科技有限公司)。

1.7 统计学处理

2 结 果

2.1 缺氧97H细胞对巨噬细胞极化的影响

RT-qPCR技术检测结果显示,THP-1组以及THP-1+PMA组细胞中CD11b基因的相对表达量分别为1.001±0.059、3.931±0.027,两组比较差异具有显著性(t=78.14,P<0.05)。

M2组、97H-N+M0组及97H-H+M0组巨噬细胞中CD163、CD206和TNF-α基因的相对表达量比较,差异均有显著性(F=319.90～494.20,P<0.05),各组间两两比较差异均有显著性(t=14.23～46.88,P<0.05)。见表1。

表1 3组细胞中CD163、CD206和TNF-α基因相对表达量比较

2.2 缺氧肝细胞癌分泌的外泌体对巨噬细胞的摄取和极化产生的影响

Western blot方法结果显示,与97H组比较,exo-N组和exo-H组提取的蛋白混合物中高表达Alix,基本不表达钙联蛋白(图1)。生物透射电子显微镜以及NTA结果显示,外泌体颗粒呈双凹圆盘状微小囊泡,直径30～150 nm,见图2。

图1 缺氧肝癌细胞源性外泌体中Alix和钙联蛋白表达情况

图2 缺氧肝癌细胞源性外泌体的形态(200倍)

RT-qPCR检测的结果显示,exo-N+M0组和exo-H+M0组M0巨噬细胞中CD206基因的相对表达量分别为1.000±0.010、2.852±0.188,两组比较差异具有显著性(t=17.06,P<0.05)。荧光显微镜下观察显示M0巨噬细胞内出现带有橙红色荧光的颗粒(图中白色箭头指示处),表示外泌体被M0巨噬细胞吞噬。见图3。

图3 缺氧肝癌细胞源性外泌体Dil荧光染色(50倍)

2.3 缺氧97H细胞来源的外泌体miR-1260b对M2巨噬细胞极化的影响

RT-qPCR技术检测结果显示,exo-N和exo-H组外泌体中的miR-1260b基因的相对表达量分别为1.000±0.007、2.133±0.162,两组比较差异有显著性(t=12.09,P<0.05)。M0-NC组与M0-Mimic组的miR-1260b基因的相对表达量分别为1.000±0.038、32.903±0.570,CD206基因的相对表达量分别为1.001±0.049、1.325±0.337,TNF-α基因的相对表达量分别为1.000±0.021、0.705±0.058,M0-Mimic组与M0-NC组比较,miR-1260b、CD206基因的相对表达量显著高表达(t=96.70、8.82,P<0.05),而TNF-α基因的相对表达量显著降低(t=8.22,P<0.05)。

M2-NC IN组与M2-IN组中miR-1260b基因的相对表达量分别为1.000±0.035、0.052±0.002,CD206基因的相对表达量分别为1.002±0.069、1.000±0.021,TNF-α基因的相对表达量分别为1.000±0.008、3.428±0.249,M2-IN与M2-NC IN组比较,miR-1260b基因的相对表达量显著降低,TNF-α基因的相对表达量则显著增高(t=47.31、16.88,P<0.05),CD206基因的相对表达量比较无显著差异(P>0.05)。

2.4 miR-1260b Mimic/Inhibitor对缺氧97H细胞诱导M2巨噬细胞的调节作用

RT-qPCR检测结果显示,M0-NC+M0组与97H-Mimic+M0组M0巨噬细胞中的CD206基因的相对表达量分别为1.005±0.125、5.037±0.227,TNF-α基因相对表达量则分别为1.001±0.056、0.278±0.017,两组比较,CD206和TNF-α相对表达量具有显著差异(t=26.95、21.45,P<0.05)。

97H-N+M0组、97H-H+M0组以及97H-H-1260 IN+M0组M0巨噬细胞中的CD206基因的相对表达量则分别为1.001±0.053、3.209±0.576、0.652±0.038,TNF-α基因的相对表达量分别为1.003±0.049、0.456±0.025、1.089±0.026,各组间CD206和TNF-α比较差异均有显著性(F=36.50、44.07,P<0.05),其中,与97H-H+M0组比较,97H-H-1260 IN+M0组M0巨噬细胞中CD206基因的相对表达量显著降低,TNF-α基因的相对表达量显著升高(t=9.09、12.54,P<0.05)。

3 讨 论

我国是HCC高发国家,据统计人群中HCC发病率高达18.2/10万［13-14］。TAM是肿瘤微环境中主要的免疫细胞,可以极化为M1或M2亚型,M2巨噬细胞具有促进肿瘤细胞进展的作用［15］。不同的巨噬细胞亚型均具有特异性标志物,例如M0巨噬细胞以CD11b基因高表达为特征,M1巨噬细胞高表达TNF-α,而M2巨噬细胞则高表达CD206、CD163［10,16］。研究发现,缺氧环境下肿瘤细胞的外泌体中富含免疫调节蛋白和趋化因子［17］,还包含有能促进M2巨噬细胞极化的miRNA分子。

研究发现,免疫细胞中的M2巨噬细胞可以通过上调PD-L1或者是分泌抗炎细胞因子IL-10抑制CD8+T细胞、CD4+T细胞等免疫细胞活性,以此重塑免疫微环境,从而促进肝癌细胞的免疫逃逸［18-20］。除此之外,M2巨噬细胞有促进血管和淋巴管生成、肿瘤细胞的增殖和转移等作用,有促癌的作用,而M1巨噬细胞则具有抗癌的作用。因此探索缺氧肿瘤细胞通过分泌外泌体诱导M2-TAM极化的具体机制,找到控制TAM由M2转化为M1表型的具体靶向分子,对于提高HCC患者的预后至关重要。目前在黑色素瘤、胶质瘤、胰腺癌、肺癌多种肿瘤中,均被证实缺氧肿瘤细胞可以通过诱导M2巨噬细胞极化调节肿瘤进展［17,21-23］。本研究结果显示,缺氧97H细胞可以促进M2巨噬细胞极化,并高表达基因CD206、CD163,与WANG等［24］研究结果一致。同时本研究通过体外实验首次证实,在M0巨噬细胞中转染miR-1260b Mimic可以有效地诱导M2巨噬细胞极化,而靶向抑制miR-1260b的表达则可以有效控制巨噬细胞M2亚型转化为M1亚型。总之,本研究发现缺氧肝癌细胞来源的miR-1260b可以诱导M2巨噬细胞极化。

miRNA是一类不具有蛋白质编码功能的内源性小分子RNA,主要通过特异性识别mRNA的3′非编码区靶向降解mRNA,从而影响基因的表达水平,发挥调节细胞稳态的作用［25］。研究发现,相较于癌旁组织,miR-1260b在HCC组织当中高表达,miR-1260b可以通过抑制G蛋白信号调节因子从而促进肝癌细胞的增殖,即miR-1260b具有促瘤效应［26-27］。体外研究发现,向巨噬细胞培养基中加入ERK抑制剂后,巨噬细胞内miR-1260b表达显著上调,miR-1260b可能是影响M2巨噬细胞极化的重要分子［28］。由此可以推测,在缺氧97H细胞影响巨噬细胞极化的这一过程中,miR-1260b可能是促进巨噬细胞M2标记物CD206基因高表达的原因。并且,miR-1260b还被发现是缺氧肝癌细胞分泌的外泌体中的差异性分子［29］。因此可以推断,外泌体源性miR-1260b可能是缺氧环境下肝癌细胞调节M2巨噬细胞极化的主要分子。本研究通过提取以及分离缺氧97H细胞的外泌体,探究了miR-1260b对M2巨噬细胞极化的影响机制。本研究成功提取了外泌体颗粒,此颗粒已经过NTA分析、生物透射电子显微镜观察和Western blot方法验证。然后,本研究将缺氧肝癌源性外泌体颗粒与巨噬细胞共培养后,RT-qPCR检测结果显示,缺氧肿瘤源性外泌体可以诱导M0巨噬细胞高表达M2巨噬细胞标志物CD206。本研究还发现缺氧97H细胞来源的外泌体高表达miR-1260b基因,由此可以推测,miR-1260b极有可能是缺氧97H细胞通过外泌体诱导M2巨噬细胞极化的关键靶分子。

miRNA Mimic/Inhibitor是通过化学合成的方法合成的特定miRNA模拟物/抑制剂,可利用细胞转染的方式进入细胞内增强或削弱内源miRNA的调控作用,以此进行功能获得性/缺失性研究。为了进一步探究miR-1260b在诱导M2巨噬细胞亚型极化中的作用,本研究向M0巨噬细胞内转染miR-1260b Mimic,结果显示M2巨噬细胞亚型标志物CD206高表达,然而在M2巨噬细胞内转染miR-1260b Inhibitor后,结果显示,可以显著上调M1巨噬细胞亚型标志物TNF-α的表达,而对CD206的调节作用不明显,提示miR-1260b可能是缺氧97H细胞源性外泌体中导致M2巨噬细胞极化的主要调节分子,并且在M2巨噬细胞中抑制miR-1260b的表达以后可以有逆转M2巨噬细胞亚型转化为M1亚型的可能性。同时,本研究还发现,转染了miR-1260b Mimic的肝癌细胞共培养M0巨噬细胞后,可以诱导M0巨噬细胞向M2巨噬细胞的极化。而转染了miR-1260b Inhibitor的缺氧97H细胞,相较于缺氧97H细胞共培养M0巨噬细胞后,可以有效逆转缺氧97H细胞诱导M2巨噬细胞极化。

综上所述,本研究结果显示,缺氧97H细胞可以通过外泌体诱导M2巨噬细胞极化,并且缺氧肝癌细胞源性外泌体中的miR-1260b被首次发现是导致M2巨噬细胞极化发生免疫抑制的关键分子,为HCC免疫治疗方面的研究提供了理论支持。

作者声明：韩冰、杨晔妮、赵梓吟参与了研究设计;杨晔妮、王有鹏、孙洪发和张顺参与了论文的写作和修改。所有作者均阅读并同意发表该论文。所有作者声明不存在利益冲突。