OTUD3敲除对神经干细胞中缝隙连接蛋白43表达的影响

徐同迎 焦倩 姜宏

(青岛大学基础医学院,山东省神经相关疾病的机制与重点防治实验室,山东省沿海地区神经退变疾病协同创新中心,山东 青岛 266071)

神经干细胞(NSCs)存在于哺乳动物胚胎的脑组织以及成年人侧脑室室管膜下区和海马齿状回颗粒下层中,具有自我增殖和分化的潜能［1-3］。中枢神经系统受到损伤以后,静止的NSCs被激活并参与到中枢神经系统的损伤修复过程中［4］。去泛素化酶(DUBs)可以逆转蛋白质泛素化降解过程,进而影响多种生物学过程,包括细胞凋亡和自噬、调节细胞周期和干细胞的发育等［5-8］。卵巢肿瘤结构域蛋白(OTUs)是DUBs家族成员,具有内源性连锁特异性［9-10］。OTUD3是OTUs亚家族中的一员,与肿瘤的发生发展和神经退行性疾病关系密切,其底物包括PTEN、GRP78、p53和IRP2蛋白［8,11-14］。缝隙连接蛋白(Cx)通道是机体大多数组织中相邻细胞间及细胞与细胞外区域进行物质交换和信号交流主要通道［15-16］。其中Cx43是Cx中分布最广泛家族成员［17］,与基因转录、发育、自噬调节、细胞内运输和细胞外小泡介导远程通讯有关［18-20］。OTUD3是否调节Cx43而参与NSCs增殖分化等生物学行为,目前尚未见相关报道。本研究利用OTUD3敲除(OTUD3-/-)的胚胎小鼠,于体外分离并且培养OTUD3-/-和野生型(WT)胚胎小鼠NSCs,检测OTUD3对NSCs中Cx43表达影响,同时提取胚胎小鼠脑皮质蛋白,验证OTUD3对Cx43表达影响。

1 材料和方法

1.1 实验试剂

表皮生长因子(EGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、N-2 supplement、B-27 supplement购自美国Gibco公司;GAPDH抗体和Cx43抗体购自美国CST公司;OTUD3抗体购自美国Abcam公司;Ki67抗体、Nestin抗体、β-tubulin Ⅲ抗体购自美国Millipore公司;羊抗兔IgG-HRP购自中国爱博泰克生物公司;ECL发光液购自美国Millipore公司。

1.2 实验动物及其饲养

3月龄OTUD3-/-小鼠(中国军事医学科学院提供)和3月龄WT小鼠(北京维通利华实验动物技术有限公司提供)置于恒温(21±2)℃、恒湿(50±10)%、12-12 h昼夜交替光照下饲养,自由饮水与取食。同种基因型小鼠之间进行交配,待妊娠第14天时,异氟烷气体麻醉孕鼠,以体积分数0.75的乙醇消毒腹部后,沿腹中线剪开,使用镊子取出串珠样OTUD3-/-小鼠和WT胚胎小鼠各3只,置于预冷的PBS中,用于后续实验。

1.3 实验方法

1.3.1胚胎小鼠脑皮质组织的提取 剥离出所有OTUD3-/-和WT胚胎小鼠的全部脑组织,剔除脑膜后分离脑皮质组织。取出每只胚胎小鼠的一部分脑皮质组织置入1.5 mL EP管内,加入配置好的蛋白裂解液,组织研磨仪研磨1 min,冰上裂解30 min后,4 ℃下12 000 r/min离心20 min,提取脑皮质组织蛋白用于后续实验。

1.3.2NSCs的分离和传代 将OTUD3-/-和WT胚胎小鼠剩余部分脑皮质组织,剪碎至1 mm×1 mm×1 mm,使用1 mL枪头反复吹打组织直至形成细胞悬液,400目筛网过滤后置于大离心管中,以1 000 r/min离心5 min,弃去上清液;加入完全培养液重悬细胞,细胞计数后将其接种于75 cm2培养瓶中,接种密度约为1×108个/L,并分别标记为OTUD3-/--NSCs和WT-NSCs,置于37 ℃、含体积分数0.05的CO2细胞培养箱中进行培养;隔天添加完全培养基,培养4～6 d时,根据细胞状态(细胞生长所形成神经球聚集增多时)传代,传至第3代时,于倒置显微镜下观察第1、3天时OTUD3-/--NSCs和WT-NSCs的生长状态。

1.3.3NSCs的培养 将高压灭菌后的玻片置于24孔板中,加入多聚赖氨酸溶液室温下孵育5 min,0.01 mol/L PBS洗2次后,超净台晾干;将传代至第3代的神经球消化为单细胞后,调整细胞密度为1×109个/L,接种细胞悬液至上面制备好的玻片上,置于37 ℃、含体积分数为0.05的CO2细胞培养箱中培养。取OTUD3-/--NSCs和WT-NSCs各3个玻片,使用完全培养基贴壁培养3 d以后,用于检测Ki67;取OTUD3-/--NSCs和WT-NSCs各6个玻片,使用分化培养基贴壁培养7 d以后,用于检测Nestin和β-tubulin Ⅲ。

1.3.4细胞免疫荧光染色 将前面培养3 d或7 d的OTUD3-/--NSCs和WT-NSCs玻片从24孔板取出,吸弃培养基,用4 ℃预冷的4% PFA溶液室温固定30 min,0.01 mol/L的PBS清洗3次,每次5 min,加入封闭液,室温下封闭1 h;向使用完全培养基培养3 d的NSCs中加入Ki67一抗(1∶400),向使用分化培养基培养7 d的NSCs中加入Nestin一抗(1∶100)和β-tubulin Ⅲ一抗(1∶500),室温孵育1 h后,4 ℃摇床孵育过夜,0.01 mol/L PBS洗3次,每次5 min;加入AF555或AF488标记的荧光二抗(1∶500),室温避光孵育1 h;将含DAPI封片液滴于载玻片上,将生长细胞的玻片面缓慢接触封片液,避光保存,倒置荧光显微镜下观察并拍照。

1.3.5Western blotting方法检测脑皮质和NSCs中OTUD3和Cx43表达水平 NSCs培养至第3代时,传代后接种于6孔板(2 mL/孔)中,每组设置3个复孔,调整密度为1×108个细胞/L;继续培养至细胞融合度约90%时,加入已配置好的蛋白裂解液,组织研磨仪研磨1 min,冰上裂解30 min后,4 ℃下12 000 r/min离心20 min,提取NSCs蛋白用于后续实验。配制聚丙酰胺凝胶,向凝胶孔加入1.3.1中制备好的脑皮质组织蛋白样品或NSCs蛋白样品,电压调至80 V进行SDS蛋白电泳,待样品进入分离胶后,将电压调为120 V,PVDF转膜,使用100 g/L脱脂奶粉室温封闭2 h以后,分别加入OTUD3一抗(1∶1 000)和Cx43一抗(1∶1 000),4 ℃摇床孵育过夜,次日使用TBST洗条带3次,每次10 min;根据一抗种属加入HRP偶联的山羊抗兔二抗(1∶10 000),于室温下孵育1 h后,TBST漂洗3次,每次洗10 min,ECL化学发光液避光孵育1 min显影。使用Image J软件分析蛋白条带灰度值,以GAPDH条带结果作为内参照,计算目的蛋白的相对表达量。

2 结 果

2.1 WT和OTUD3-/-胚胎小鼠NSCs的鉴定

倒置显微镜下观察显示,第3代OTUD3-/--NSCs和WT-NSCs培养1 d时均形成由多细胞组成的神经球,培养3 d时增殖形成的神经球均增多(图1)。细胞免疫荧光染色检测结果显示,使用完全培养基培养3 d时的WT-NSCs和OTUD3-/--NSCs当中Ki67均染色阳性(图2A),图中绿色为Ki67;使用分化培养基培养至第7天WT-NSCs和OTUD3-/--NSCs中Nestin和β-tubulin Ⅲ均染色阳性(图2B),其中绿色为Nestin,红色为β-tubulin Ⅲ。通过以上结果可以鉴定本研究中原代提取培养的细胞为NSCs,具有增殖和分化能力。

图1 第3代WT-NSCs和OTUD3-/--NSCs培养第1、3天时神经球生长状况(4倍)

A：第3代WT-NSCs和OTUD3-/--NSCs培养第3天时Ki67染色呈阳性(细胞免疫荧光染色,10倍),B：第3代WT-NSCs和OTUD3-/--NSCs培养第7天时Nestin和β-Tubulin Ⅲ染色阳性(细胞免疫荧光染色,40倍)

2.2 WT和OTUD3-/-胚胎小鼠NSCs和脑皮质组织中OTUD3、Cx43的表达情况

Western blotting法检测结果示,WT-NSCs当中OTUD3、Cx43条带灰度值分别为1.023±0.062、1.035±0.093;OTUD3-/--NSCs中无OTUD3蛋白表达,Cx43条带的灰度值为0.592±0.102。WT-NSCs和OTUD3-/--NSCs的上述两种蛋白比较,差异均有显著意义(t=16.82、3.21,P<0.05),见图3A。WT胚胎小鼠脑皮质组织中OTUD3、Cx43条带的灰度值分别为0.929±0.060、0.905±0.0149;OTUD3-/-胚胎小鼠脑皮质组织中无OTUD3蛋白表达,Cx43条带灰度值为0.522±0.012,WT胚胎小鼠和OTUD3-/-胚胎小鼠脑皮质组织上述两种蛋白比较,差异均具有显著意义(t=10.04、20.41,P<0.05),见图3B。

A：WT-NSCs和OTUD3-/--NSCs中OTUD3、Cx43表达,B：WT和OTUD3-/-胚胎小鼠脑皮质中OTUD3、Cx43表达

3 讨 论

NSCs是一类具有自我增殖和分化潜能的细胞,在神经系统发育和修复受损神经组织中发挥重要作用,具有修复和代替受损脑组织的功能,并可以重建部分神经功能环路［3,21-22］。近年研究发现神经系统疾病的发生发展与缝隙连接密切相关,缝隙连接在细胞间信息传递、物质交换和维持内环境稳态方面都发挥重要作用［23］。Cx43在神经元与星形胶质细胞、星形胶质细胞与少突胶质细胞间可以传递死亡信号以及钙超载等危险信号［24］。也有研究表明Cx43可以通过氧化应激和内质网应激调控肾小管上皮细胞损伤,抑制Cx43后可以促进细胞生长并提升细胞对于应激情况的抵抗能力［25］,但目前具体机制尚不清楚。NSCs存在于哺乳动物胚胎期的大脑,胚胎小鼠大脑皮质中有大量的NSCs,Cx43在胚胎发育期的脑组织中广泛表达,本研究选择胚胎期第14天小鼠的脑皮质区,体外培养NSCs,探讨Cx43调控NSCs生物行为学的具体机制。

泛素化信号通路在神经发育和神经元生理功能中发挥重要的调控作用,而DUBs作为调节蛋白泛素化的中心分子,其对神经系统的调控受到越来越多的关注。OTUD3属于DUBs家族,是OTUs亚家族中的一员［11］,其功能具有组织特异性和时间特异性,可通过调控不同靶蛋白的稳定性,调控细胞周期和细胞增殖［26］。OTUD3可以稳定PTEN蛋白表达水平,PTEN的缺乏可以调控细胞周期相关基因cyclinB2和cyclinD1,进而缩短细胞周期,影响NSCs增殖分化［11］。本研究中使用异氟烷气体麻醉孕鼠以后取出串珠样胚胎小鼠,分离提取胚胎WT和OTUD3-/-小鼠NSCs,分别标记为WT-NSCs和OTUD3-/--NSCs,在完全培养基中进行培养,倒置显微镜下观察其生长状态良好。Ki67是一种表达于细胞周期G1、S、G2和M期的核抗原,其表达水平能够客观地反映细胞的增殖状态。本研究应用细胞免疫荧光染色对第3代培养了3 d的WT-NSCs和OTUD3-/--NSCs进行Ki67检测,结果为阳性;应用细胞免疫荧光染色对第3代培养了7 d的WT-NSCs和OTUD3-/--NSCs进行Nestin和β-tubulin Ⅲ检测,结果为阳性,提示本研究中原代提取培养的细胞为NSCs,并有增殖和分化能力。

接下来,本研究应用Western blotting技术检测敲除OTUD3后胚胎小鼠NSCs和脑皮质组织中OTUD3蛋白的表达情况,结果显示,与WT-NSCs相比,OTUD3-/--NSCs无OTUD3蛋白的表达;与WT胚胎小鼠脑皮质组织相比,OTUD3-/-胚胎小鼠脑皮质组织也无OTUD3蛋白的表达,提示胚胎小鼠NSCs中和脑皮质组织中OTUD3敲除成功。

Cx43参与细胞增殖过程,通过控制cyclinD1-CDK4-p27复合体的核转位,进而阻断细胞周期进程［27］。NSCs发育的同时,Cx亚型的表达模式也会发生变化,Cx43在胚胎发育期的脑组织中广泛表达［28］。随着NSCs在体内分化为神经元,Cx43表达水平下降,但是Cx43在NSCs表达调控仍需进一步研究。为明确Cx43在OTUD3调控NSCs生物学功能中的作用,本研究采用Western blotting技术检测敲除OTUD3后胚胎小鼠脑皮质和NSCs中Cx43的表达情况,结果显示OTUD3-/--NSCs中Cx43表达水平明显降低,同时在动物水平进一步验证,显示OTUD3-/-后Cx43表达明显降低,由于Cx43是NSCs增殖的抑制蛋白,通过改变细胞周期进展参与调控NSCs的增殖行为。而OTUD3可以通过调控下游靶蛋白,调控细胞增殖和分化。由此推测OTUD3可能通过调控Cx43影响NSCs的增殖和分化等生物学行为,进而影响神经发生。

综上所述,敲除OTUD3后体外培养的NSCs中Cx43表达下降,可能通过影响细胞间的连接,进而促进NSCs的增殖,在神经发育过程发挥着重要作用。但OTUD3是否通过影响其泛素化水平影响Cx43表达,具体调节机制仍需进一步探讨。

伦理批准和动物权利声明：本研究涉及的所有动物实验均已通过青岛大学医学部伦理委员会的审核批准(文件号QDU-AEC-20233-47)。所有实验过程均遵照《伦理委员会标准/守则》的条例进行。

作者声明：所有作者均参与了研究的设计、论文的写作和修改。所有作者均阅读并同意发表该论文,且均声明不存在利益冲突。