菌酶协同异步发酵中草药对断奶仔猪生长、腹泻、免疫和抗氧化性能的影响

姜玫宏　葛金山　程金龙　彭宇晗　姜淑贞　朱元召

摘要： 以3種加工处理的中草药饲喂断奶仔猪，研究其对断奶仔猪生长、腹泻、免疫、血清脂与酶及抗氧化等指标的影响。120头28±2日龄杜长大断奶仔猪分4组，3组中草药处理组饲粮分别含2%粉碎复方中草药、2%复方中草药提取液和2%发酵复方中草药，对照组饲粮不含中草药，试验期为28 d。结果表明，与对照组相比，粉碎中草药组断奶仔猪料质量比（F/G）、总蛋白（TP）含量、球蛋白（GLB）含量、总抗氧化能力（T-AOC）和超氧化物歧化酶（SOD）含量均有显著差异（P<0.05）；中草药提取液组平均日增质量（ADG）、F/G、试验全期腹泻指数、免疫球蛋白G（IgG）含量、白蛋白（ALB）含量、GLB含量、TP含量、谷丙转氨酶（ALT）含量、谷草转氨酶（AST）含量、碱性磷酸酶（ALP）含量、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX）含量、总抗氧化能力（T-AOC）、SOD含量和丙二醛（MDA）含量均有显著差异（P<0.05）；发酵中草药组ADG、平均日采食量（ADFI）、F/G、腹泻指数、血清IgG含量、免疫球蛋白A（IgA）含量、免疫球蛋白M（IgM）含量、ALB含量、GLB含量、TP含量、总胆固醇（TC）含量、甘油三酯（TG）含量、ALT含量、AST含量、ALP含量、GSH-PX含量、过氧化氢酶（CAT）含量、T-AOC、SOD含量和MDA含量均有显著变化（P<0.05）。由此可见，与对照组及粉碎中草药组、中草药提取液组相比，发酵中草药组中草药经菌酶协同先好氧后厌氧异步发酵能较好地改善断奶仔猪生长性能，具有抗腹泻、增强机体免疫和抗氧化功能，提示与中草药功效增强和发酵代谢产物作用叠加有关。

关键词： 菌酶协同；异步发酵；复方中草药；断奶仔猪；生长；免疫

中图分类号： S816.7 文献标识码： A 文章编号： 1000-4440（2023）01-0126-08

Effects of bacteria-enzymes synergistic asynchronous fermentation of Chinese herbal medicine on growth， diarrhea， immunity and antioxidant of weaned piglets

JIANG Mei-hong¹， GE Jin-shan²， CHENG Jin-long³， PENG Yu-han¹， JIANG Shu-zhen⁴， ZHU Yuan-zhao^1，5

（1.Anhui Science and Technology University， Fengyang 233100， China;2.Shandong Zhongcheng Feed Technology Co.， Ltd.， Feicheng 271600， China;3.Jiangsu Unison Biotechnology Development Co.， Ltd.， Suqian 223800， China;4.Shandong Agricultural University， Taian 271000， China;5.Hebei Heliomy Biotechnology Co.， Ltd.， Qingxian 062650， China）

Abstract： The effects of three processed Chinese herbal medicines on growth， diarrhea， immunity， serum lipids and enzymes and antioxidant of weaned piglets were studied. One hundred and twenty Duroc-Landrace-Yorkshire weaned piglets at 28±2 days of age were divided into four groups. The control group was fed with no Chinese herbal medicine， and the crushed Chinese herbal medicine group， Chinese herbal extract group and fermented Chinese herbal medicine group were fed with 2% crushed Chinese herbal medicine， 2% compound Chinese herbal medicine extract and 2% fermented Chinese herbal medicine， respectively. The experiment lasted for 28 days. Compared with the control group， the crushed Chinese herbal medicine group was significantly different in the ratio of feed and gain （F/G）， total protein （TP） content， globulin （GLB） content， total antioxidant capacity （T-AOC） and superoxide dismutase （SOD） content （P<0.05）， the Chinese herbal medicine extract group was significantly different in average daily gain （ADG）， F/G， diarrhea index， immunoglobulin G （IgG） content， albumin （ALB） content， GLB content， TP content， alanine aminotransferase （ALT） content， aspartate aminotransferase （AST） content， alkaline phosphatase （ALP） content， glutathione peroxidase （GSH-PX） content， T-AOC， SOD content and malonaldehyde （MDA） content （P<0.05）， and the fermented Chinese herbal medicine group was significantly different in ADG， average daily feed intake （ADFI）， F/G， diarrhea index， IgG content， immunoglobulin A （IgA） content， immunoglobulin M （IgM） content， ALB content， GLB content， TP content， total cholesterol （TC） content， triglyceride （TG） content， ALT content， AST content， ALP content， GSH-PX content， catalase （CAT） content， T-AOC， SOD content and MDA content （P<0.05）. Compared with the control group， crushed Chinese herbal medicine group and Chinese herbal medicine extract group， the fermented Chinese herbal medicine group can improve the growth performance of weaned piglets， enhance immune and antioxidant functions， and has anti-diarrhea by aerobic and anaerobic asynchronous fermentation with bacteria and enzymes， suggesting that it is related to the superposition between the enhanced effect of Chinese herbal medicine and fermentation metabolites.

Key words： bacteria-enzymes synergy;asynchronous fermentation;compound Chinese herbal medicine;weaned piglets;growth;immunity

自2020年饲用抗生素禁用以来，中草药因能通过适度调节和系统整合来平衡体内各项机能^[1]、含有多糖等多种活性物质而发挥独特的免疫调节和抗氧化等功效^[2]、具有耐受性低和副作用少等特点^[3]，已成为抗生素替代品主要研究方向之一。中草药药效与加工处理方法有关，采取粉碎工艺时，中草药坚硬的细胞壁不能被彻底物理裂解，胞内所含活性成分不能充分释放；采用水和有机溶剂提取时，中草药种类、有效成分的溶解性以及提取温度、压力和质量浓度的差异等都会影响中草药药效发挥，并且应用成本高。而中草药经有益菌发酵后，能增强与微生物种群的协同作用，释放更多活性成分，提高药效，减轻毒性^[4-5]。此外，发酵中草药不仅具有治疗疾病和保健作用，还可增强免疫力、提高产品品质、减少应激反应^[6-7]，调节肠道微生物菌群^[8]。

仔猪的断奶应激会导致肠道菌群失调，增加发病率和死亡率^[9]。吴东等^[10]研究发现，发酵中草药可改善仔猪健康状况，增强胃肠道代谢吸收功能。郭建来等^[11]发现发酵复方党参可提高断奶仔猪抗病能力。上述有关发酵中草药研究多在厌氧和无酶协同条件下进行，单一厌氧发酵对植物细胞壁降解作用有限。因此，本研究拟优选复合有益菌和复合酶，采用菌酶联合、先好氧再厌氧的二步发酵法，对配伍的抑菌型复方中草药进行异步发酵，通过纤维素酶和好氧菌发酵以增加微生物对中草药细胞壁的降解能力，从而促进中草药活性成分的释放，通过厌氧发酵叠加发挥微生态的菌群调控作用，并比较研究粉碎中草药、中草药提取物对断奶仔猪生长、腹泻、血清免疫、脂、酶、抗氧化指标影响的差异，以期为异步酶解發酵中草药应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 复方中草药及配伍 将十大功劳叶、苦木、石榴皮、马齿苋和鬼针草分别粉碎过40目筛，按6∶4∶4∶3∶3比例混合。中草药购自亳州市乾元动物药业有限公司。

1.1.2 酶 纤维素酶：酶活性为10 000 U/g；复合酶：由蛋白酶5 000 U/g、甘露聚糖酶200 U/g、α-淀粉酶250 U/g、葡聚糖酶10 000 U/g组成。均由广东溢多利生物股份科技有限公司提供。

1.1.3 菌株 2×10¹⁰CFU/g枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）和1×10¹⁰CFU/g植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）由江苏优仕生物科技发展有限公司提供。

1.2 复方中草药提取液制备

采用水煎煮提取法。复方中草药与水的比例为1∶3。先用50%总水量浸泡粉碎中草药2 h，并加热沸腾煎煮30 min，滤出汁液。再加余下的50%水，煎煮20 min，滤出汁液。将2次滤出汁液合并混匀，制备得到复方中草药提取液。

1.3 发酵复方中草药制备

采用菌酶联合异步发酵法。第一步进行菌酶协同好氧发酵：按表1原料组成，先将玉米粉、豆粕粉与复方中草药、纤维素酶和复合酶按比例混合均匀，再将50%红糖、枯草芽孢杆菌放入50%的40～45 ℃温水中，活化30～45 min后，均匀接种至上述混合物中，37 ℃条件下好氧发酵20 h。第二步进行厌氧发酵：先将余下的50%红糖、植物乳杆菌放入50%的40～45 ℃温水中，活化30～45 min，均匀接种至好氧发酵后的混合物中，密闭，37 ℃条件下厌氧发酵5 d，制备得到发酵复方中草药。

1.4 试验分组与饲粮

120头28±2日龄杜长大断奶仔猪被分为4组，各组设3个重复，各重复饲养10头。对照组饲粮无中草药，粉碎中草药组、中草药提取液组和发酵中草药组分别饲喂含2%粉碎复方中草药、2%复方中草药提取液、2%发酵复方中草药的试验组饲粮。试验期共28 d，每天14：00清扫猪舍，每周进行一次消毒，保持猪舍良好通风。饲粮中所含的粉碎复方中草药、复方中草药提取液和发酵复方中草药的组成及含量见表1，饲粮配方与营养水平见表2。

1.5 主要试验仪器

MindrayBS-200型全自动生化分析仪、Multiskan GO型酶标仪。

1.6 指标测定

1.6.1 生长性能 每天结料与记录仔猪采食量。在试验第1 d、第14 d和第28 d早晨06：00，称量已空腹12 h的仔猪质量。计算平均日增质量（ADG）、平均日采食量（ADFI）和料质量比（F/G）。

1.6.2 腹泻指数 每天观察记录断奶仔猪粪便和腹泻情况，按表3进行评分，评分由5人组成的评分组分别打分，取平均值。再计算断奶仔猪试验第1～2周、第3～4周和全期1～4周的腹泻指数，腹泻指数=粪便评分之和/仔猪头数。

1.6.3 免疫指标 在试验第28 d，对断奶仔猪停料不停水24 h，1头采集10 ml前腔静脉血。将全血于4 ℃静置10 min后，再经3 000 r/min离心15 min，分离出血清。测定血清免疫球蛋白G（IgG）、免疫球蛋白A（IgA）、免疫球蛋白M（IgM）及总蛋白（TP）、白蛋白（ALB）和球蛋白（GLB）的含量。

1.6.4 血清脂与酶 包括谷草转氨酶（AST）、谷丙转氨酶（ALT）、碱性磷酸酶（ALP）、乳酸脱氢酶（LDH）、甘油三酯（TG）、总胆固醇（TC）。

1.6.5 血清抗氧化指标 包括过氧化氢酶（CAT）、總抗氧化能力（T-AOC）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX）及丙二醛（MDA）。

1.7 数据统计分析

试验数据用IBM SPSS 21.0 软件进行单因素方差分析，采用邓肯氏法多重比较检验，P<0.05 为差异显著，结果以平均值±标准差表示。

2 结果与分析

2.1 菌酶协同异步发酵中草药对断奶仔猪生长性能的影响

由表4可知，与对照组相比，粉碎中草药组断奶仔猪F/G显著降低17.20%（P<0.05）；中草药提取液组平均日增质量提高28.86%（P<0.05），F/G显著降低15.59%（P<0.05）；发酵中草药组平均日增质量和平均日采食量分别显著提高40.27%和16.82%（P<0.05），F/G显著降低16.67%（P<0.05）。3种加工方式中草药组间平均日增质量和F/G均无显著差异`（P>0.05）；与粉碎中草药组相比，中草药提取液组平均日采食量无显著差异（P>0.05），发酵中草药组仔猪平均日采食量显著提高15.77%（P<0.05）；平均日采食量在中草药提取液组与发酵中草药组间无显著差异（P>0.05）。

2.2 菌酶协同异步发酵中草药对断奶仔猪抗腹泻的影响

表5显示，相对于对照组，粉碎中草药组腹泻指数在试验各期均无显著变化（P>0.05），中草药提取液组腹泻指数在前期和后期无显著降低（P>0.05），但在全期显著降低39.97%（P<0.05）；发酵中草药组腹泻指数在前期、后期和全期分别降低33.15%、74.96%和46.71%，差异均显著（P<0.05）。3种加工方式中草药组间腹泻指数在前期和全期均无显著不同；在后期，仅发酵中草药组腹泻指数较粉碎中草药组显著降低62.44%（P<0.05）。

2.3 菌酶协同异步发酵中草药对断奶仔猪免疫功能的影响

表6显示，相对于对照组，粉碎中草药组仔猪血清球蛋白和总蛋白的含量均有显著提高（P<0.05），中草药提取液组血清免疫球蛋白G、白蛋白、球蛋白和总蛋白的含量均显著提高（P<0.05），发酵中草药组血清免疫球蛋白G、免疫球蛋白A、免疫球蛋白M、白蛋白、球蛋白和总蛋白的含量分别显著提高14.58%、15.38%、35.71%、39.57%、47.28%和44.77% （P<0.05）。3种加工方式中草药组间免疫球蛋白G和免疫球蛋白M水平均无显著不同（P>0.05），中草药提取液组球蛋白含量较粉碎中草药组显著提高15.00%（P<0.05）。发酵中草药组球蛋白含量较粉碎中草药组和中草药提取液组分别显著提高34.02%和16.54%（P<0.05），免疫球蛋白A和白蛋白的含量较粉碎中草药组分别显著提高13.64%和22.47%（P<0.05），总蛋白含量较粉碎中草药组和中草药提取液组分别显著提高30.20%和14.12%（P<0.05）。

2.4 菌酶协同异步发酵中草药对断奶仔猪血清脂和酶的影响

由表7可知，发酵中草药组各血清脂和酶指标含量最低。与对照组相比，粉碎中草药组断奶仔猪血清各脂、酶含量均无显著差异（P>0.05），中草药提取液组血清谷丙转氨酶、谷草转氨酶和碱性磷酸酶的含量分别显著降低20.34%、18.75%和9.88% （P<0.05），发酵中草药组总胆固醇、甘油三酯、谷丙转氨酶、谷草转氨酶和碱性磷酸酶的含量分别显著降低27.46%、20.51%、28.82%、23.12%和14.70%（P<0.05）。3种加工方式中草药组间甘油三酯、谷草转氨酶、碱性磷酸酶和乳酸脱氢酶均无显著变化（P>0.05），发酵中草药组总胆固醇含量较粉碎中草药组和中草药提取液组分别显著降低22.18%和10.46%（P<0.05），发酵中草药组和中草药提取液组谷丙转氨酶含量较粉碎中草药组分别显著降低25.00%和16.07%（P<0.05）。

2.5 菌酶协同异步发酵中草药对断奶仔猪抗氧化性能的影响

由表8可知，与对照组相比，粉碎中草药组断奶仔猪血清总抗氧化能力和超氧化物歧化酶含量分别显著提高15.50%和10.76%（P<0.05）；中草药提取液组谷胱甘肽过氧化物酶含量、总抗氧化能力和超氧化物歧化酶含量分别显著提高12.02%、22.51%和16.73%（P<0.05），丙二醛含量显著降低24.41%（P<0.05）；发酵中草药组谷胱甘肽过氧化物酶含量、过氧化氢酶含量、总抗氧化能力和超氧化物歧化酶含量分别显著提高13.17%、50.44%、42.80%和38.42%（P<0.05），丙二醛含量显著降低33.66%（P<0.05）。3种加工方式中草药组间谷胱甘肽过氧化物酶含量和丙二醛含量均无显著差异（P>0.05）；发酵中草药组总抗氧化能力和过氧化氢酶含量较粉碎中草药组分别显著提高23.64%和45.15%（P<0.05），超氧化物歧化酶含量较粉碎中草药组和中草药提取液组分别显著提高24.98%和18.59%（P<0.05）。

3 讨论

3.1 不同加工方式中草药对断奶仔猪生长性能的影响

研究结果表明，发酵绞股蓝、地黄根等中药可促进断奶仔猪生长代谢，减少粪便有害气体排放^[12]。断奶仔猪饲喂0.40%由乳酸菌、芽孢杆菌和酵母菌发酵的党参、黄芪等5种复方中草药，ADG显著提高25.05%、F/G显著降低25.00%^[13]，本试验发酵中草药组与上述结果较为相似。用乳酸菌、枯草芽孢杆菌和酵母菌发酵黄芪、白术等复方中草药，2.00%发酵中草药组较未发酵组断奶仔猪ADG显著提高^[14]。本试验发酵中草药组ADG较对照组显著提高，较未发酵粉碎中草药组ADG有一定程度提高，而粉碎中草药组ADG较对照组无显著提高。中草药坚硬的细胞壁主要含木质素、纤维素、果胶等结构成分，因不易被裂解，影响胞内活性成分的释放，从而影响中草药的功效。本试验采用芽孢杆菌先好氧、乳酸菌后厌氧，并与纤维素酶协同的异步发酵方式，试验结果不仅提示菌酶共同发酵能较充分降解中草药致密的细胞壁结构，更多地释放被细胞壁包裹的胞内活性物质，还说明过40目筛的粉碎加工处理方式对中草药细胞壁的分解作用仍有限。此外，菌酶协同异步发酵还产生大量有机酸和内源性酶，能够减轻中草药苦味，改善饲粮适口性，促进消化吸收^[15]，从而改善断奶仔猪生长、降低料质量比。本试验中草药提取液组较无中草药对照组显著提高断奶仔猪平均日增质量，而粉碎中草药组平均日增质量与对照组差异不显著，说明中草药的煎煮水提取加工方式与普通粉碎处理对仔猪生长性能的影响不同。

3.2 菌酶协同异步发酵中草药对断奶仔猪腹泻与免疫功能的影响

健康仔猪胃肠道微生物保持相对稳定状态，断奶应激使肠壁黏膜屏障功能受损，消化功能紊乱，同时自身免疫机制还未成熟，致病性微生物大量繁殖，腹泻频发^[16]。张玉千^[17]用嗜酸乳杆菌、安琪啤酒酵母和植物乳杆菌发酵五倍子、女贞子、山楂、甘草和厚朴等中药渣，仔猪经饲喂后，腹泻率显著降低73.65%。发酵复方中草药使仔猪腹泻率显著降低65.23%^[18]。添加0.20%发酵茯苓、黄芪、陈皮等复方中草药，断奶仔猪血清IgG含量和TP含量分别显著提高9.78%和6.48%，IgA含量和IgM含量无显著不同^[19]。本试验发酵中草药具有抗腹泻和增强免疫功能作用，较对照组腹泻指数在试验各期均显著降低，试验4周后腹泻指数下降46.71%，血清IgG、IgA、IgM、ALB、GLB、TP含量均显著提高，与上述研究结果稍有差异，这与复方中草药配伍、功效和发酵处理有关。本试验所选十大功劳叶能消炎止泻^[20]，石榴皮鞣花酸具有修复肠道损伤和抗腹泻功能^[21]，马齿苋粗多糖能抑制有害微生物^[22]，苦木能燥湿止痢^[23]，苦木、马齿苋中所含生物碱类、皂苷类化合物有抑菌抗病毒和增强机体免疫力功效^[24-25]。发酵中药还可完善肠道功能^[26]，促进对饲粮的消化吸收。粉碎中草药组较对照组腹泻指数及IgG、IgA、IgM、ALB含量无显著变化，提示与普通粉碎加工对中草药细胞壁物理破壁不充分有关。中草药提取液组较对照组腹泻指数降低，血清IgG、ALB、GLB、TP含量均显著提高，反映中草药水提取工艺能增强药效，石榴皮提取物中鞣花酸能减轻小鼠结肠炎症状的结果间接佐证此推测^[27]。

3.3 不同加工方式中草药对断奶仔猪血清脂、酶的影响

TC、TG含量是机体对脂类物质吸收利用的指标。添加由当归、川芎等13种原料配伍的复方中草药，家兔血清TC、TG含量分别显著降低9.67%和40.00%^[28]。本试验发酵中草药组仔猪血清脂含量较对照组均显著降低，粉碎中草药组和中草药提取液组均无显著变化，表明发酵中草药能增强仔猪脂肪代谢、降低体内脂肪沉积，其机理尚需进一步研究。

血清酶反映机体物质代谢和健康状况。ALT、AST和ALP主要存在于肝细胞胞浆和线粒体中，反映肝脏代谢机能和损伤程度。LDH主要存在于肾脏中，与细胞活性功能相关。添加由杜仲、黄芪、山楂、甘草配伍的复方中草药，仔猪血清ALT、AST含量分别显著降低6.02%和7.86%^[29]。发酵北苍术组断奶仔猪血清ALT含量显著降低3.81%，AST含量无显著变化^[30]。本试验结果显示，与对照组相比，中草药提取液组和发酵中草药组均显著降低仔猪血清AST、ALT和ALP的水平，而添加粉碎中草药不能显著改善血清酶的含量，这与上述结果存在一定差异，推测与复方中草药组成及加工方式有关。本试验苦木中所含苦木总生物碱具有降低转氨酶活性功效^[25]，尤其是中草药经长时间高温煎煮提取或发酵处理，细胞内生物碱类、粗多糖等有效物质能更多释放，药效增强，保证了仔猪肝脏等器官的正常发育和健康。

3.4 不同加工方式中草药对断奶仔猪血清抗氧化性能的影响

抗氧化能力反映动物机体应激程度和健康状况。断奶应激反应使仔猪机体自由基代谢失常，抗自由基系统损伤过度，诱发疾病。研究结果表明，发酵中草药组较对照组仔猪血清GSH-PX含量、SOD含量和T-AOC分別显著提高21.46%、15.75%和16.71%，MDA含量显著降低24.87%^[14]。断奶仔猪饲喂经枯草芽孢杆菌发酵的中草药，血清总超氧化物歧化酶含量和GSH-PX含量显著提高，MDA含量无显著不同^[31]。用植物乳杆菌发酵黄芩药渣比未发酵组和对照组有更明显的抗氧化功能^[32]。本试验发酵中草药组断奶仔猪血清T-AOC和GSH-PX、SOD、CAT含量较对照组均显著提高，MDA含量显著降低，较粉碎中草药组T-AOC和SOD、CAT含量均显著提高；中草药提取液组较对照组T-AOC和GSH-PX、SOD含量均显著提高，MDA含量显著降低，这是由于本试验所用十大功劳叶、鬼针草、石榴皮和马齿苋均有抗氧化功效^[24，33-35]，石榴皮多糖、马齿苋有还原能力和清除自由基作用^[36-37]。但除T-AOC和SOD含量外，粉碎中草药组并未显著改善仔猪血清抗氧化功能，而菌酶协同异步发酵中草药能增加中草药抗氧化等活性成分的释放。中草药经混菌发酵后，纤维含量显著降低，且发酵后大部分物质含量有不同程度提高^[38]。

4 结论

与对照和粉碎中草药相比，采用菌酶协同异步发酵十大功劳叶、苦木、石榴皮、鬼针草、马齿苋配伍的抑菌性复方中草药，可改善断奶仔猪生长状况，减少腹泻，提高机体代谢、免疫、抗氧化功能，其机制可能是中草药的抑菌功效、菌酶裂解中草药细胞壁后增加中草药活性成分的释放功效以及活菌等发酵代谢产物对胃肠道菌群平衡调控的三重叠加作用。

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（责任编辑：张震林）