达格列净通过miR-140-5p/FNDC5通路调控高糖诱导内皮细胞增殖、凋亡的机制研究

徐伟忠 陈爱华

糖尿病血管病变是一种最常见的糖尿病并发症,慢性血管并发症常伴有血管内皮功能障碍,这是糖尿病患者致残、死亡的主要原因[1,2]。达格列净(dapagliflozin,DAPA)是首个上市的钠-葡萄糖协同转运蛋白2(SGLT-2)抑制剂降糖药物,目前市面上还有卡格列净、恩格列净、依格列净、鲁格列净、托格列净等SGLT-2抑制剂[3,4]。微小RNA(miRNA)是一种长度在18～25个核苷酸的内源性单链内编码的保守小分子,其通过调控靶基因的转录、翻译过程影响蛋白的表达,进而广泛参与人类各种疾病的发展[5,6]。miR-140-5p是新发现的一种糖尿病失调miRNA[7],但是其在糖尿病血管病变中的作用及潜在的机制是否与DAPA之间存在关联尚未可知。本研究拟以高糖诱导的内皮细胞为研究对象,观察DAPA对其中miR-140-5p、FNDC5的表达及miR-140-5p、FNDC5对内皮细胞增殖、凋亡的影响,揭示DAPA发挥治疗作用与miR-140-5p/FNDC5之间的关系。

1 材料与方法

1.1 材料 人脐静脉血管内皮细胞HUVEC购自美国菌种保藏中心;达格列净(商品名:安达唐)购自阿斯利康制药有限公司;Lipofectamin 3000转染试剂购自赛默飞世尔科技(中国)公司;细胞计数试剂盒(cell counting kit,CCK8)购自日本同仁化学研究所;膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素(annexin v-fluoresceine isothiocyanate,annexin V-FITC)/碘化丙锭(propidium iodide,PI)细胞凋亡检测试剂盒购自上海碧云天研究所;DNA/RNA抽提试剂盒、实时荧光定量聚合酶链反应(real time fluorescence quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)试剂盒均购自日本Takera;双荧光素酶报告基因试剂盒购自上海信裕。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养:人脐静脉血管内皮细胞HUVEC用DMEM培养基(混有10%胎牛血清+1%青链霉素)培养,在5%CO2的37℃恒温细胞培养箱中常规培养。隔天更换1次培养液。

1.2.2 细胞转染与分组:葡萄糖(5.5、30 mmol/L)处理HUVEC细胞6 h分别标记为 正常NG组、高糖HG组。达格列净DAPA(20、40、80 μmol/L)孵育2 h的HG组细胞分别标记为20 μmol/L组、40 μmol/L组、80 μmol/L组。使用5倍量的Lipofectamin 3000脂质体将agomiRNA组(转染agomiRNA)、agomiR-140-5p组(转染agomiR-140-5p)、antagomiRNA组(转染antagomiRNA)、antagomiR-140-5p组(转染antagomiR-140-5p)、si-NC组(转染si-NC)、si-FNDC5组(转染si-FNDC5)、pcDNA组(转染pcDNA)、pcDNA-FNDC5组(转染pcDNA-FNDC5)、80 μmol/L+agomiRNA组(转染agomiRNA再用80 μmol/L处理)、80 μmol/L+agomiR-140-5p组(转染agomiR-140-5p再用80 μmol/L的DAPA处理)、80 μmol/L+agomiR-140-5p+pcDNA组(共转染agomiR-140-5p和pcDNA并用80 μmol/L的DAPA处理)、80 μmol/L+agomiR-140-5p+pcDNA-FNDC5组(共转染agomiR-140-5p和pcDNA-FNDC5并用80 μmol/L的DAPA处理)转染至内皮细胞,12 h后,更换新培养液进行HG处理或80 μmol/L的DAPA处理。RT-qPCR实验检测细胞的转染情况。

1.2.3 CCK8实验检测细胞增殖:收集细胞,用培养液调整密度0.5×105个/ml,取200 μl分装置96孔板,培养12 h。取CCK8液10 μl,微微震荡混匀,避光孵育20 min。酶标仪调至490 nm波长,在此波长下检测细胞吸光值(OD490)。细胞增殖率(%)=(OD490实验组/OD490对照组-1)×100%。

1.2.4 流式细胞术检测细胞凋亡:收集细胞,预冷PBS洗涤5次,500 μl结合缓冲液悬浮细胞。取Annexin V-FITC(10 μl)、PI(10 μl)充分混合,避光孵育15 min,结束后快速上流式细胞仪分析细胞凋亡。细胞总凋亡率=早期凋亡率+晚期凋亡率。

1.2.5 WB实验检测细胞FNDC5、Ki67、PCNA、caspase-3的蛋白表达:收集前面处理好的细胞,RIPA裂解液冰上充分裂解,提取总蛋白。BCA法定量,沸水浴变性。SDS-PAGE进行蛋白电泳,按照流程电泳-封闭-转膜-封闭-Ⅰ抗孵育-Ⅱ抗孵育-显影曝光操作。最后用Image J软件分析条带的灰度,用条带的相对灰度值表示蛋白的相对表达量。一抗稀释倍数:兔抗FNDC5多抗,1∶1 500;兔抗Ki67多抗,1∶1 000;兔抗PCNA多抗,1∶1 000;兔抗caspase-3多抗,1∶1 000。二抗稀释倍数:HRP标记的二抗,1∶500。一抗孵育条件:37℃,摇床孵育3 h,充分洗膜。二抗孵育条件:37℃,2 h。

1.2.6 RT-qPCR试验检测细胞miR-140-5p、FNDC5的表达:收集细胞,使用试剂盒提取总RNA并合成cDNA,-20℃保存备用。按照RT-qPCR试剂盒说明书要求操作检测cDNA中miR-140-5p、FNDC5的水平。U6、GAPDH作为内参,2-ΔΔCt法计算样本中miR-140-5p、FNDC5的相对表达水平。

1.2.7 双荧光素酶报告基因试验检测细胞荧光活性:使用Targetscan(http://www.targetscan.org/)预测miR-140-5p的下游靶基因,发现FNDC5与miR-140-5p之间存在互补的结合序列。根据预测到的结合位点合成含有结合位点的片段(FNDC5 3′ UTR-WT)和不含结合位点的片段(FNDC5 3′ UTR-MUT),插入荧光载体,构建荧光报告基因载体。将载体与agomiRNA、agomiR-140-5p、antagomiRNA、antagomiR-140-5p转染至内皮细胞,使用双荧光素酶报告试剂盒,严格按照说明书要求操作检测细胞的荧光活性。

2 结果

2.1 不同浓度DAPA对高糖诱导的内皮细胞生存的影响 与NG组比较,HG组细胞增殖率显著降低,凋亡率显著升高,Ki67、PCNA的蛋白表达均显著降低,caspase-3的蛋白表达显著升高(P<0.05)。与HG组比较,40、80 μmol/L组细胞增殖率显著升高,凋亡率显著降低,Ki67、PCNA的蛋白表达均显著升高,caspase-3的蛋白表达显著降低(P<0.05)。见图1,表1。

表1 DAPA对高糖诱导内皮细胞增殖、凋亡的影响 n=9,

图1 不同浓度DAPA处理的高糖诱导内皮细胞凋亡及增殖、凋亡相关蛋白表达;A Ki67、PCNA、caspase-3的蛋白图;B DAPA处理的高糖诱导内皮细胞凋亡图

2.2 不同浓度DAPA对高糖诱导的内皮细胞中miR-140-5p、FNDC5表达的影响 与NG组比较,HG组细胞miR-140-5p表达显著升高,FNDC5的mRNA和蛋白表达均显著降低(P<0.05)。与HG组比较,40、80 μmol/L 组细胞miR-140-5p表达显著降低,FNDC5的mRNA和蛋白表达均显著升高(P<0.05)。见图2,表2。

表2 DAPA对高糖诱导内皮细胞miR-140-5p、FNDC5表达的影响n=9,

图2 DAPA处理的高糖诱导内皮细胞FNDC5蛋白图

2.3 miR-140-5p对高糖诱导的内皮细胞存活的影响 与agomiRNA组比较,agomiR-140-5p组细胞增殖率显著降低,凋亡率显著升高,Ki67、PCNA的蛋白表达均显著降低(P<0.05),caspase-3的蛋白表达显著升高(P<0.05)。与antagomiRNA组比较,antagomiR-140-5p组细胞增殖率显著升高,凋亡率显著降低,Ki67、PCNA的蛋白表达均显著升高,caspase-3的蛋白表达显著降低,差异均有统计学意义(P<0.05)。见图3,表3。

表3 miR-140-5p对高糖诱导的内皮细胞增殖、凋亡的影响 n=9,

2.4 FNDC5对高糖诱导的内皮细胞存活的影响 与si-NC组比较,si-FNDC5组细胞增殖率显著降低,凋亡率显著升高,Ki67、PCNA的蛋白表达均显著降低,caspase-3的蛋白表达显著升高(P<0.05)。与pcDNA组比较,pcDNA-FNDC5组细胞增殖率显著升高,凋亡率显著降低,Ki67、PCNA的蛋白表达均显著升高,caspase-3的蛋白表达显著降低(P<0.05)。见图4,表4。

表4 FNDC5对高糖诱导的内皮细胞增殖、凋亡的影响 n=9,

图4 FNDC5对高糖诱导内皮细胞凋亡及增殖、凋亡相关蛋白的表达;A FNDC5处理的高糖诱导内皮细胞凋亡图;B Ki67、PCNA、caspase-3的蛋白图

2.5 miR-140-5p靶向FNDC5 Targetscan(http://www.targetscan.org/)预测到miR-140-5p与FNDC5之间互补的结合位点。双荧光素酶报告实验,与agomiRNA组比较,agomiR-140-5p组FNDC5 3’UTR-WT细胞的荧光活性显著降低(P<0.05)。与agomiRNA组比较,agomiR-140-5p组细胞FNDC5的mRNA和蛋白表达均显著降低(P<0.05),与antagomiRNA组比较,antagomiR-140-5p组细胞FNDC5的mRNA和蛋白表达均显著升高,差异有统计学意义(P<0.05)。见图5,表5。

表5 miR-140-5p对荧光素酶相对活性、FNDC5 mRNA和蛋白相对表达的影响 n=3,

图5 miR-140-5p靶向FNDC5;A miR-140-5p与FNDC5的互补序列;B miR-140-5p调控FNDC5蛋白表达

2.6 过表达FNDC5对DAPA、miR-140-5p调控高糖诱导的内皮细胞存活功能的作用 与80 μmol/L+agomiRNA组比较,80 μmol/L+agomiR-140-5p组细胞增殖率显著降低,凋亡率显著升高,Ki67、PCNA蛋白表达均显著降低,caspase-3蛋白表达显著升高(P<0.05)。与80 μmol/L+agomiR-140-5p+pcDNA组比较,80 μmol/L+agomiR-140-5p +pcDNA-FNDC5组细胞增殖率显著升高,凋亡率显著降低,Ki67、PCNA蛋白表达均显著升高,caspase-3蛋白表达显著降低(P<0.05)。见图6,表6。

表6 过表达FNDC5和miR-140-5p对DAPA调控高糖诱导内皮细胞增殖、凋亡的影响n=9,

图6 过表达FNDC5和miR-140-5p对DAPA调控高糖诱导内皮细胞凋亡及增殖、凋亡相关蛋白的表达;A 凋亡图;B Ki67、PCNA、caspase-3的蛋白图

3 讨论

DAPA属于SGLT-2抑制剂之一,现已在世界范围内广泛用于T2DM的临床治疗[8]。但是DAPA发挥保护作用的相关机制尚未十分清楚。miR-140参与人类很多疾病的发生发展过程,包括糖尿病[9]。但是miR-140在糖尿病中的作用机制尚未十分清楚。Fan等[10]研究发现,异氟醚能够加重糖尿病大鼠的认知障碍,上调miR-140-5p,且抑制miR-140-5p可减轻异氟醚对糖尿病大鼠的认知损伤,发挥神经保护作用,同时上调分类连接蛋白12(SNX12),揭示抑制miR-140-5p能够通过上调SNX12减轻异氟醚的糖尿病神经毒性。Zou等[11]发现,梓醇对糖尿病心肌病小鼠具有保护作用,其作用机制为通过调节糖尿病心肌病小鼠体内的长非编码RNA核旁小斑组装转录物1(NEAT1)/miR-140-5p/组蛋白去乙酰化酶4(HDAC4)通路减轻心肌损伤。结果显示,miR-140-5p在高糖诱导的小鼠心肌细胞中表达降低,过表达miR-140-5p可挽救NEAT1诱导的心肌细胞凋亡。

本研究发现,miR-140-5p在HG诱导的内皮细胞中高表达,并且过表达miR-140-5p加重高糖对内皮细胞的增殖抑制和凋亡促进作用,而抑制miR-140-5p则可减弱高糖对内皮细胞生存的损害作用。这个研究结果与Fan的实验结果相一致,与Zou的研究结果相悖。进一步研究发现,miR-140-5p靶向负调控PDX1,暗示PDX1可能参与了miR-140-5p对高糖诱导内皮细胞存活的保护作用。

很多研究均报道称,FNDC5有利于T2DM血糖恢复[12,13]。Lin等[14]发现,在高糖(HG)/高脂肪(HF)处理的心肌细胞中,FNDC5/虹膜蛋白表达显著降低,HG/HF处理的H9C2细胞中一氧化氮合酶(iNOS)、NADPH氧化酶2(NOX2)、3-硝基酪氨酸(3-NT)、活性氧(ROS)和过氧亚硝酸盐(ONOO-)的水平均明显升高,促进氧化/亚硝化应激,FNDC5/虹膜蛋白是T2DM的潜在治疗靶点。Jiang等[15]研究发现,在链脲佐菌素(STZ)诱导的1型糖尿病小鼠、高脂饮食(HFD)诱导的肥胖小鼠和糖尿病小鼠中,皮下脂肪中循环虹膜素和FNDC5表达下调,血浆虹膜素水平与皮下脂肪FNDC5表达呈正相关,表明皮下脂肪源性FNDC5/虹膜蛋白在代谢性疾病中起调节作用。本研究结果显示:FNDC5在HG诱导的内皮细胞中表达下调,这与前人的研究结果相吻合。敲减FNDC5抑制内皮细胞增殖,促进凋亡,而过表达FNDC5则具有相反的保护内皮细胞作用。这说明FNDC5有益于高糖环境下内皮细胞的存活。重要的是,过表达FNDC5还能够减轻miR-140-5p对内皮细胞存活的损害作用,加强DAPA对内皮细胞的保护功能。

综上所述,达格列净促进高糖诱导的内皮细胞增殖,抑制凋亡,有助于内皮细胞在高糖环境下的存活,产生这种作用的机制与抑制miR-140-5p/FNDC5通路有关,为T2DM的治疗提供理论支持。