麝香化瘀醒脑颗粒的长期毒性试验研究Δ

袁 渊,李启泉,杨云芳,黄 锐,蒲清荣#

(1.国家中医临床研究基地建设单位-西南医科大学附属中医医院循证医学中心,四川 泸州 646000; 2.国家中医临床研究基地建设单位-西南医科大学附属中医医院神经内科,四川 泸州 646000; 3.国家中医临床研究基地建设单位-西南医科大学附属中医医院制剂室,四川 泸州646000)

麝香化瘀醒脑颗粒(川药制字Z20220413000)是西南医科大学附属中医医院心脑病科白雪教授在中医玄府理论基础上,提出“脑玄府”“脑病从风论治”的创新理论应用成果,该方在出血性脑卒中的临床治疗中运用多年,疗效较好,获得医患肯定。组方由麝香、黄芪、泽泻、三七、桂枝和生大黄等多味药构成,其中麝香为君药,重在开通脑之玄府,开窍醒神;黄芪大补元气,为臣药;泽泻、三七为佐药,利水渗湿,活血化瘀;桂枝、生大黄为使药,通络、活血;全方益气化瘀,利水开窍,用于出血性脑卒中急性期[1-5]。前期研究结果显示,使用该方汤剂主要成分治疗自体尾动脉血注入尾壳核制备大鼠脑出血模型,可显著改善脑出血模型大鼠神经功能,减轻脑出血后细胞毒性水肿和血管源性水肿,并促进出血侧血脑屏障修复[6-10]。在此基础上,课题组进一步研究开通玄府法的作用机制,发现该方改善脑出血血脑屏障功能的机制可能是通过微循环的改善,提升超氧化物歧化酶活性,降低丙二醛水平,抑制基质金属蛋白酶-9表达,保护血脑屏障,抑制其通透性,从而缓解脑部水肿,同时提高脑源性神经营养因子表达水平以保护脑部神经。本研究在参考《药物非临床研究质量管理规范》(CFDA2017年第34号文)[11]和草本植物制剂临床前安全性评价内容[12]的基础上,开展麝香化瘀醒脑颗粒长期毒性试验研究,观察其在长期持续给药条件下可能导致的大鼠毒性反应,并定位可能的器官或组织,推导该药在连续使用时的剂量安全范围,为临床研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SPF级SD大鼠120只,雌雄各半,体重80～120 g,5～6周龄,来源于四川省中医药科学院实验动物中心[动物批号:SCXK(川)2018-19号]。动物数量、研究设计及动物的处理均已通过四川省中医药科学院实验动物伦理委员会审批[批准号:SYLL(2021)-039],并严格按照向实验动物伦理委员会申报的内容执行。研究环境位于四川省中医药科学院实验动物中心(SPF级标准),使用许可证号:SCXK(川)2018-100。室温条件18～22 ℃,昼夜温差≤3 ℃,湿度60%～70%,空气净化10～15次/h,12 h明暗交叉光照。

1.2 仪器

JA1203 N型电子天平(上海精密科学仪器有限公司);K-Lite8B型电解质分析仪(梅州康立高科技有限公司);BC-6700全自动血液细胞分析仪、BS-880型全自动生化分析仪(深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司);STA-RMAX型全自动凝血分析仪(法国Stago公司)。

1.3 药品与试剂

麝香化瘀醒脑颗粒由水提干浸膏粉(1 g干浸膏粉相当于原药材5.01 g,批号:20210326)和三七+麝香粉末(批号:20210331)两部分组成,由西南医科大学附属中医医院制剂室提供,密封保存。甲醛(分析纯)由成都市科隆化学品有限公司提供(批号:2021030501),主要检测试剂见表1。

表1 主要检测试剂信息Tab 1 Main information of detection reagent

1.4 药品的配制

称取水提干浸膏粉383.3 g,三七+麝香粉末126.2 g,纯水配制成2.046 g生药/mL;取2.046 g/mL混悬液250 mL,纯水稀释成1.023 g/mL混悬液500 mL;取1.023 g/mL混悬液150 mL,纯水稀释成300 mL混悬液0.512 g生药/mL;上述混悬液于4 ℃冷藏备用。

1.5 实验方法

急性毒性试验结果显示,麝香化瘀醒脑颗粒小鼠最大给药量为244.8 g生药/kg,拟用临床剂量为0.817 g生药/kg,参考长期毒性试验相关技术要求[12-14],设计大鼠长期毒性试验给药期限为30 d,小剂量组10.23 g/kg(12.5倍临床拟用量),中剂量组20.46 g/kg(25倍临床拟用量),大剂量组40.92 g/kg(50倍临床拟用量)。大鼠饲养观察1周,进行给药前体重、采食量记录。按30只/组和5只/笼的设定,根据体重将动物均分为4组。给药30 d后,各组处死20只动物(雌雄各半);给药30 d,各组处死动物10只(雌雄各半)。研究期间,各给药组大鼠按20 mL/kg的给药量每日上午9∶00—11∶00灌胃1次,空白组大鼠给予等体积超纯水,持续30 d。根据每周体重调整给药体积。常规体征观察于每日灌胃前后进行,内容包括外观、行为动作、皮毛、呼吸、粪便、尿液及(眼、耳、口、鼻和外阴)分泌物等。每周观测1次大鼠摄食量和体重,血液学、血生化、系统尸解、脏器指数(脏器湿重g/100 g体重)和组织病理学检测在给药30 d后进行[14-17]。

1.6 统计学方法

2 结果

2.1 大鼠一般情况观察

麝香化瘀醒脑颗粒给药期间,各组动物皮毛光滑,行为活动未见异常,眼、耳、鼻、肛门和生殖器等天然孔均无异常分泌物。给药30 d摄食量与体重增长变化正常,各给药组与空白组大鼠比较,差异均无统计学意义(P>0.05),见表2、图1。

表2 麝香化瘀醒脑颗粒对大鼠平均日摄食量的影响Tab 2 Effect of Shexiang Huayu Xingnao granules on average daily food intake of rats

A.雄性;B.雌性A. male; B. female图1 麝香化瘀醒脑颗粒对大鼠体重的影响Fig 1 Effects of Shexiang Huayu Xingnao granules on body weight of rats

2.2 麝香化瘀醒脑颗粒对血常规的影响

灌胃给药30 d后,与空白组雄鼠比较,中剂量组雄鼠淋巴细胞百分比显著降低,中性粒细胞百分比显著升高(P<0.05);与空白组雌鼠比较,大剂量组雌鼠嗜碱性粒细胞百分比显著降低(P<0.05),差异均有统计学意义,但以上改变为正常参考值范围内波动,无毒理学意义,见表3。

表3 麝香化瘀醒脑颗粒给药30 d对大鼠血常规的影响Tab 3 Effects of Shexiang Huayu Xingnao granules on blood routine examination of rats for 30 days n=10)

2.3 麝香化瘀醒脑颗粒对血清生化指标的影响

给药30 d后,与空白组雄鼠比较,大剂量组雄鼠肌酸激酶、葡萄糖水平降低,大、中剂量组雄鼠血清钠水平升高,大、中及小剂量组雄鼠血清氯水平升高;与空白组雌鼠比较,中、小剂量组雌鼠血清总胆红素水平降低,差异均有统计学意义(P<0.05);但以上指标改变在正常参考值范围内,无毒理学意义,见表4。

表4 麝香化瘀醒脑颗粒给药30 d对大鼠血清生化指标的影响Tab 4 Effects of Shexiang Huayu Xingnao granules on serum biochemical indicators of rats for 30 days n=10)

2.4 麝香化瘀醒脑颗粒对内脏器官的影响

解剖发现,各组动物天然孔未见异常分泌物,皮下未见肿块、黄染;胸腔心、肺,腹腔肝、脾、肾和胰腺等组织排列位置、颜色正常,未见积液。主要脏器指数方面,给药30 d后,各剂量组雄鼠脑、心、肝、脾、肺、肾、肾上腺、胸腺、睾丸和附睾脏器指数与空白组比较,差异均无统计学意义(P>0.05);与空白组比较,大剂量组雌鼠肾脏指数明显增大,差异有统计学意义(P<0.05),其余脏器指数与空白组的差异无统计学意义(P>0.05),见表5。

表5 麝香化瘀醒脑颗粒给药30 d对大鼠脏器指数的影响Tab 5 Effects of Shexiang Huayu Xingnao granules on visceral index of rats for 30 days n=10)

2.5 组织病理学检查

镜下观察显示,给药30 d,与空白组比较,大剂量组大鼠的主要脏器均未见组织病理学明显改变,见表6。

表6 大鼠主要脏器组织病理检查结果(n=10,只)Tab 6 Results of pathological examination of major viscera of rats (n=10,pieces)

3 讨论

在中药毒理学的研究中,对于未上市但符合中医药理论且有临床应用经验的中药复方制剂,国内外一般采用单种动物开展毒性试验研究,而对于由中药、天然药物中提取的有效部位和有效成分制成的制剂则通常采用大鼠或小鼠等啮齿类以及beagle犬等非啮齿类[20-21]。鉴于此,课题组在前期玄府法治疗脑出血研究的经验和颗粒制备工艺研究基础上,采用SD大鼠作为长期毒性试验的研究对象,观察麝香化瘀醒脑颗粒长时间反复多次给药条件下可能对大鼠产生的毒性反应。

给药30 d,系统解剖发现,大剂量组雌鼠与空白组比较,肾脏指数差异明显,但大剂量组雌鼠血液生化指标中与肾脏相关的TP、UREA和CREA水平等均正常,病理镜检显示大剂量组雌鼠肾脏组织被膜光滑完整,皮质、髓质和肾盂等均未见明显异常病理改变,无炎症渗出或增生,肾小球毛细血管正常,肾小管与集合小管内未发现蛋白管型或细胞管型,间质正常。故该差异虽有统计学意义,但无毒理学意义。给药30 d,病理组织学检查发现,空白组和大剂量组(雄性)、空白组和大剂量组(雌性)分别或单独出现了1～2例肝窦炎症细胞浸润和肝细胞灶状坏死、肾上腺组织炎症细胞浸润和肾脏组织点状坏死、膀胱组织固有层炎症细胞浸润和上皮细胞脱落、肺间质炎症细胞浸润和气管组织上皮细胞脱落、前列腺组织腺泡上皮细胞脱落和前列腺间质内炎症细胞浸润等病理改变。以上病变每组仅有1～2只大鼠出现,空白组大鼠亦有发生,且大剂量组和空白组病变程度相差不大,故可能是由于动物自身及饲养环境、个体差异等因素引起的自发性病变,考虑与受试药物无直接关系。结合一般观察、血常规和血生化指标的研究结果,麝香化瘀醒脑颗粒20.46 g生药/kg(相当于临床拟用量25倍)及以下剂量对大鼠持续给药30 d是安全的。

综上所述,本研究结果为麝香化瘀醒脑颗粒药效学研究提供了研究基础,并为药物的进一步开发提供了依据。