浅析高数值孔径对STED超分辨显微成像的影响

时金蒙 张会芳 郝振莉

（黄河水利职业技术学院，河南 开封 475004）

0 前言

STED 超分辨率显微镜已被广泛应用于大气水体环境物质检测、生理病理检测以及生物制剂研制与生产等领域，具有分辨率高、聚焦能力强等优点[1]。对传统的显微成像效果影响因素的研究较为成熟，对STED 超分辨率显微成像影响因素的研究还有较大的提升空间[2]。当前，很多使用者片面认为数值孔径越大，STED 超分辨率显微镜的成像效果一定就越好[3]，未进行更深入的定量定性分析。实际情况并非完全如此，因此，研究高数值孔径对STED 超分辨率显微成像的影响具有重要的理论和现实意义。

该文按照从理论到实际的思路，分别对STED 超分辨率显微镜的原理、作用以及不同评价指标等进行阐述，从有利影响、不利影响2 个方面论述了高数值孔径对STED 超分辨率显微成像的影响，并提出了一种新颖的定量确定高数值孔径的算法。

1 STED 超分辨率显微成像

受激辐射损耗（STED）对设备要求相对较高，可以实时拍摄且成像速度快，医学实践中常用于活细胞成像追踪与检测。

1.1 STED 超分辨率显微成像的原理和作用

STED 显微技术作为第一个突破光学衍射极限的远场显微成像技术，其基本原理是采用2 束激光同时照射样品，其中一束激光用来激发荧光分子，使物镜焦点艾里斑范围内的荧光分子处于激发态；同时，用另外一束中心光强为0 cd的环形损耗激光与其叠加，使物镜焦点艾里斑边沿区域处于激发态的荧光分子通过受激辐射损耗过程返回基态而不自发辐射荧光，因此只有中心区域的荧光分子可以自发辐射荧光，从而获得超衍射极限的荧光发光点。

1.2 STED 超分辨率显微成像的评价指标

STED 超分辨率显微成像技术有多项评价指标，一般是针对物镜的。

1.2.1 分辨率

显微镜的分辨率是最核心的指标，它是指能够清晰区分2 个物点的最小间距，在有些场合又被称为鉴别率。物镜的分辨率与光线波长成正比，与数值孔径成反比。由于在现实中选择不同波长光线的可能性不大，因此数值孔径成为影响分辨率的唯一因素。

1.2.2 焦深

焦深就是焦点深度，是指当用物镜进行对焦时，在焦点上、下延伸一定范围，在这个范围内也是完全意义上的清晰区域，这个延伸范围的高度就是焦深。焦深概念引入的最大意义就是方便对所观测物体立体成像清晰度进行定量分析和评价[4]。

1.2.3 景深

当使用物镜进行对焦时，除了在焦点的上、下进行延伸以外，也可以在左、右部分延伸，左、右清洗区的长度即为景深。通俗来说，景深表示焦点左、右可以延伸到的清晰观测范围，这个清晰度不随图像的变大而变化[5]。

1.2.4 放大率和有效放大率

放大率是指显微成像的大小与被观测物质实际大小的比值，实践中一般等于目镜放大倍数与物镜放大倍数的乘积。由于受到实践中各种条件的制约，一般达不到理论放大倍数，显微镜放大倍率的极限即有效放大倍率。

1.2.5 覆盖率

由于显微镜盖玻片的厚度不标准，光线从盖玻片进入空气产生折射后的光路发生了变化，从而产生了相差，这就是覆盖差。国际上规定，盖玻片的标准厚度为0.17 mm，许可范围为0.16 mm～0.18 mm[6]。

1.2.6 视场直径

由于目镜是圆筒状的，因此检测员通过目镜观测的物质成像也是圆形背景，大小由目镜里的视场光阑决定。这个圆形背景的直径被称为视场直径，是表征肉眼能够观察到的范围大小的量值。视场直径的计算公式为视场直径=目镜视场数/物镜倍率。

2 高数值孔径对STED 超分辨率显微成像的影响

STED 超分辨率显微成像器械继承了传统显微镜的一般原理，因此在高数值孔径下具有许多优势。

2.1 数值孔径与显微成像的关系

显微镜结构及成像原理如图1 所示（195 mm 的物象距离是我国相关标准规定的）。

图1 显微镜结构及成像原理示意图

对物体的放大倍数取决于目镜放大倍数与物镜放大倍数的乘积，对显微镜来说，目镜放大倍数是根据需要由调节旋钮进行自动调节的，而物镜放大倍数需要根据不同数值孔径的选择进行调整。通常情况下，数值孔径越大，物镜放大倍数越高，相应的显微镜整体放大倍数也越高。

数值孔径NA是透镜与被检物体之间介质的折射率n和孔径角2α半数的正弦的乘积，如公式（1）所示。孔径角又称镜口角，是透镜光轴上的物体点与物镜前透镜的有效直径所形成的角度。

2.2 高数值孔径对STED 超分辨率显微成像的正面影响

2.2.1 分辨率与数值孔径之间基本上呈正相关

对传统光学成像显微镜来说，数值孔径越大，分辨率越高，在目镜中显示的物体形象就越清晰。对STED 超分辨率显微镜来说，被螺旋相位板整形的激光束经过高数值孔径透镜聚焦后，数值孔径会影响损耗光聚焦光斑的光强分布。不同的数值孔径会对损耗光聚焦光斑光强分布和半高宽度造成不同的影响，随着数值孔径的增大，半高宽度逐渐变小，最后趋于饱和。一般来说，当数值孔径增大时，STED 显微镜的分辨率会提高，但是不能证明数值孔径越大，STED 显微镜的分辨率就越大。

由于STED 显微镜分辨率与受激光照光强有统计学意义，而光强大小直接与损耗光聚焦光斑半高宽有统计学意义[7]，因此在模拟试验中，通过设置不同的数值孔径来比较数值孔径和损耗光聚焦光斑的半高宽之间的关系，该文计算了8 个不同数值孔径对应的半高宽度，结果见表1。

对STED 超分辨率显微镜来说，数值孔径突破了光的衍射限制，最高可以达到1.4 mm，由于该文研究的是高数值孔径下STED 超分辨率显微成像技术的影响，因此最低设定在普通显微镜数值孔径较大区间的起始点0.7 mm。对数值孔径在0.7 mm 以下的情况来说，该文的研究对其意义不大，因此表1 中未列出相关数据。

2.2.2 高数值孔径下STED 超分辨率显微成像视野更宽阔

光线显示的波状延伸效果被称为衍射。这就是为什么即便是使用无像差的高效能镜头也会以圆盘形状的图样延伸而不是在单点汇聚。数值孔径指示没有光学像差的镜头的聚光限制或衍射限制，这个概念被认为来自光的波状表现。这种圆盘形状的波称为爱裏斑（Airy Disk）[8]。爱裏斑（Airy Disk） 的半径r（宽度）如公式（2）所示。

式中：λ为光的波长；NA为数值孔径。

通过公式（2）得出的值称为解析度。数值孔径越大，爱裏斑 （Airy Disk） 的半径就越小；这表明数值孔径越大，影像就越清晰，这也是评估镜头的通用标准。

2.3 高数值孔径对STED 超分辨率显微成像的不利影响分析

在高数值孔径为STED 超分辨率显微成像带来很多益处的同时，也会产生一定的负面影响。

2.3.1 数值孔径过高

数值孔径过高会出现焦深和景深过小的现象。与传统光学显微成像技术一样，STED 超分辨率显微成像技术的焦深与数值孔径的平方成反比，数值孔径越大，焦深越小。焦深小，允许的模糊圈就小，需要在实际检测与拍摄过程中物距（摄距）减少，镜头焦距变短，光圈变大，会影响物体的观测、拍摄范围。焦深大， 可以看到被检物体的全层，而焦深小，则只能看到被检物体的1 个薄层。

虽然景深与焦深是不同的概念，但是数值孔径越大，景深也越小。一般来说，景深与焦深是呈正相关的，但是景深并不是越大越好。因为低倍物镜的景深较大，所以当低倍物镜照相时会面临困难。由于STED 超分辨率显微镜一半都具有较大的放大倍数，因此在其工作范围内，景深过小不利于细微图像的鉴别。

图2 中焦深为点B与点C连线，景深为点B'与点C'连线。虽然焦深和景深所代表的意义完全不同，但是可以通俗的理解为焦点实际上不是一个点，而是一个矩形区域范围，其中矩形的长度为景深，矩形的高度为焦深，两者都是表征焦点区域范围大小的重要指标。

图2 同一图像焦深和景深位置关系示意图

如果不同焦深和景深的图像不需要进行放大后观察很小范围内的图像具体效果，那么基本上没有太大区别，如果需要放大一定倍数，那么图像放大后的显示质量会存在明显的差异。以南加利福尼亚大学图像库的狒狒图像为例，放大相同倍数后，所产生的变化具体如图3 所示。

图3 不同焦深和景深情况图像baboon 对比示意图

图3 是将焦深和景深不同的512×512 八位灰度图像baboon 在MATLAB 软件中放大3 倍之后的显示效果，图片格式均为JPG。图3（a）的焦深和景深较大，图3（b）的焦深和景深较小，通过肉眼可以明显看到图3（a）比图3（b）更清晰。具体到显微成像中，当需要观察很小区域图像的具体细节时，需要通过调节目镜旋钮放大倍数进行观看，因此需要更大的焦深和景深，此时如果数值孔径过大，反而不利于提高观测精度。

2.3.2 高数值孔径处在一定区间内

高数值孔径处在一定区间内会导致受激辐射光强下降。从理论上来说，由于STED 损耗光为环状光束且其中心强度为0 cd，因此环状损耗光越强，由第一束激发光激发的荧光分子所占的区域就越小，其横向分辨率就越高。根据第2.1 节的分析可知，当数值孔径为0.7 mm～1.1 mm 时，损耗光半高宽度变窄，受激辐射光强下降的影响，光的通透力变弱，造成在此区间内分辨率降低，同时三维层析能力降低。根据第3.1 节的分析可知，显微成像技术的焦深景深不断减少，当需要精准观测某一较小范围内的情况且需要对所要观测的图像进行放大时，会出现图像模糊不清的情况。另外，由于数值孔径的变大会导致观测者必须将物距变小，因此工作距离也相应缩短。综上所述，高数值孔径给视场宽度和工作距离带来了一定的负面影响。

3 基于遗传算法的高数值孔径对STED 超分辨率显微成像的效果优化

3.1 遗传算法适用性分析

根据第2 节的分析可知，高数值孔径对STED 超分辨率显微成像具有有利影响和不利影响。在当前国内外的研究中多采用定性分析，缺乏定量分析，究竟数值孔径为多大时能够达到最好的综合效果，需要根据建立模型使用优化算法进行局部寻优与全局寻优，最终达到收敛的效果，以此确定的自变量值就是数值孔径具体的取值。实际中常用的优化算法包括遗传算法、粒子群算法、蚁群算法以及模拟退火算法等，该文以遗传算法为例，将高数值孔径对STED 超分辨率显微成像的分析由定性拓展到定量层面。

遗传算法包括3 个基本操作，分别是选择、交叉和变异。选择是指在进化的每代中，根据适应度函数计算个体的适应度，选择最佳个体及其代表的解。交叉是为了避免出现“早熟”现象，事先确定一个较小概率，每代中使用伪随机数发生器产生一个随机数，当随机数小于交叉概率时，对2个个体编码进行交叉操作（随机选取交叉位）。变异是根据变异概率随机反转某一位的二进制值，一般选取的变异概率要明显小于交叉概率，其原因是如果变异概率很大，算法就类似于独立的随机算法，失去了遗传寻优的意义。

3.2 算法的设计和实现

3.2.1 确定适应度函数

确定适应度函数的整体思路是兼顾第2.2 节的有利影响和第2.3 节的不利影响，因此应是2 个函数的和。由于是研究数值孔径对成像的影响，因此自变量只有1 个值，代表STED 高分辨率显微成像设备的数值孔径宽度或者叫做直径（用d来表示）。第一个函数是adv（d），其中又包括2 个小函数s（d）和r（d），分别代表分辨率和视野宽度随数值孔径的变化曲线，合起来代表有利影响。第二个函数是disadv（d），其中又包括3 个小函数x（d）、y（d）和z（d），分别代表焦深、景深和激光辐射光强随数值孔径变化的曲线，合起来代表不利影响。实践中根据不同的应用需求来确定每个分函数对应的不同权值。因此适应度函数如公式（3）所示。

式中：∂1～∂5为5 个不同的权值。。

3.2.2 确定步长及权值每个分函数的数值

随数值孔径的变化不是简单的线性关系，甚至不是单调关系，因此无法简单计算得出最优解。通过确定合适步长，使自变量d在较大量数值之间进行变化，通过不断的确定局部最优解来不断逼近全局最优解。随着纳米科技的不断发展和成熟应用，理论上该算法可以达到纳米级别，即计算最优解的结果精确到纳米。但实际考虑到显微成像设备制造技术尚未达到纳米级别且必须为算法效率考虑，尽量降低在普通计算机上算法耗用的时间，因此步长以10-3量级为宜。

权值的确定需要根据实际使用过程中每个评价指标的重要性排序来综合确定，是一个客观与主观相结合的灵活变化的量。权值可以采取普通形式，也可以采取归一化的形式。为了更方便进行对比，同时为其他智能优化算法预留接口，该文采取归一化的权值确定方式。同时注意权值务必使适应度函数不能是单调函数，否则最优值必然出现在边界上，失去了寻优的意义。

3.2.3 算法的流程

算法流程如下：1） 随机产生初始种群，个体数目一定，每个个体为染色体的基因编码。2） 由编码得到数值孔径大小，按照第2.2 节、第2.3 节的内容计算每个小函量值，采用公式（3）计算适应度函数。3） 每代进行最优化选择，使用轮盘赌策略确定个体的适应度，并判断是否符合优化准则，如果符合，就输出最佳个体及其代表的最优解，结束计算，否则转向第三步。记累计概率为PPi，Pi为个体的选择概率，如公式（4）所示。共轮转NP次，每次轮转时随机产生位于区间（0，1）内的随机数r，当PPi-1≤PPi时，选择个体i。因此，个体的适应值越大，其选择概率越大。4） 根据适应度选择再生个体，适应度高的个体被选中的概率高，适应度低的个体可能被淘汰。5） 按照一定的交叉概率和交叉方法生成新的个体。6） 按照一定的变异概率和变异方法生成新的个体。7） 由交叉和变异产生新一代的种群，返回到第二步。

3.3 算法性能分析

选用具体的权值和步长进行算法验证。硬件平台为Intel Core i5-5200U（2.20 GHz），4G 内存，软件平台为Windows 10（64 位）操作系统，Matlab2016Rb 软件。主要验证算法的收敛性、时空性和有效性。步长设定为0.001，权值分别为0.50、0.10、0.25、0.10 和0.05。采用第3.1 节、第3.2 节的内容进行全局寻优，重复10 次，每次均取得了收敛，自变量的平均值为1.178，平均使用时间为25.234 s。由于分辨率在该算例中的权值最大，因此在实践中对数值孔径最接近1.178 的显微成像设备和其他设备进行对比，发现分辨率在肉眼感知上明显比其他设备高。综上所述，该算法具有较好的收敛性和有效性，空间占用较小，但是算法耗费时间略高，需要在下步的研究中进行改进。

4 结语

该文按照从理论到实际的思路，从有利方面和不利方面2 个部分分析了高数值孔径对STED 超分辨率显微成像的影响。总体来看，高数值孔径下STED 超分辨率显微成像效果更好，但是也会出现很多不利的方面。该文提出了一种新颖的对高数值孔径进行定量确定的算法，使用遗传寻优的方法达到全局收敛。在下步的研究工作中，要着重从拓展算法的角度选择合适的智能算法，根据不同评价指标所占比重的不同，制定完善的目标函数，通过不断训练达到收敛的自变量值，自动确定数值孔径的最优数值，不断提高STED 超分辨率显微镜数值孔径选取的智能化、便捷化水平，并不断提高算法的时空性能。