金属离子对群体感应淬灭菌Serratia sp.Z4 中AisZ 酶的影响

赵一竹，刘 栋，杨惠婷，李亚茹，葛世玫

(温州大学生命与环境科学学院，浙江温州 325035)

群体感应（Quorum Sensing, QS）是细菌之间的一种交流方式，细菌通过合成并释放一种被称为自诱导物质（Autoinducer, AI）的信号分子，控制自身菌体密度并对环境做出一定的响应[1].细菌的很多生物行为，如生物发光、生物毒素的合成、生物膜形成[2-4]等都受群体感应的控制.N-酰化高丝氨酸内酯（Acyl-homoserine lactones, AHLs）是革兰氏阴性菌中常见的信号分子之一，根据含N-侧链的长度、3-碳位置的取代基种类以及侧链中的不饱和键类型可分为不同的种类[5].C6-HSL 是其中一种典型的信号分子，也是研究最多的信号分子之一[6].

通过群体猝灭（Quorum Quenching, QQ）可以干扰细菌的QS 系统，破坏由QS 介导的细菌聚集和活动[7].群体感应淬灭菌是一类具有群体感应淬灭能力的细菌，其所含群体淬灭酶可以通过破坏AHLs 等信号分子来干扰群体感应淬灭系统.目前已在芽孢杆菌和红球菌等多属菌中发现群体感应淬灭菌[8-9]，我们实验室也分离鉴定了一株具有高效群体淬灭能力的沙雷氏菌（Serratiasp.Z4）[10].为进一步了解其遗传机理，前期通过全基因组测序，确定了其中的一个淬灭酶编码基因aisZ（登记号：OL627346），并构建出一株具有淬灭功能的重组大肠杆菌E.coliBL21（DE3）/AisZ-pET-28a（+）.

淬灭酶有多种类型，其中金属-β-内酰胺酶样内酯酶（Metallo-β-lactamase-like Lactonases,MLL）是最早发现的，也是AHLs 内酯酶中最重要的成员之一[11]，它是一种具有多个金属结合位点以及His116-X-His118-Asp120-His121保守域的蛋白家族[12].芽孢杆菌中发现的AiiA、根癌农杆菌中的AttM/AiiB，节杆菌属中的AhlD[8,13-14]以及前期从沙雷氏菌Z4 中筛选出的AisZ 等，都属于此类酶.本研究将以AisZ 酶作为研究对象，从不同层面分析金属离子对淬灭酶AisZ 的影响，进一步了解淬灭酶AisZ 的性质和群体感应淬灭菌Z4 的遗传信息.

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 菌 株

E.coliBL21(DE3)/AisZ-pET-28a(+)为实验室前期构建的重组菌，其中含有淬灭酶基因aisZ，实验所使用的检测菌紫色杆菌（Chromobacterium Violaceum）CV026 购自北京百欧博伟生物技术有限公司.

1.1.2 培养基与试剂

LB 培养基（1 L）：酵母浸出粉5 g，胰蛋白胨10 g，NaCl 10 g，用NaOH 溶液调节pH 至7.4（固体培养基加入1.5%琼脂）.

无机盐培养基（1 L）：(NH4)2SO41.0 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，CaCl20.2 g，NaH2PO40.5 g，K2HPO40.5 g，NaCl 0.2 g，Fe2(SO4)3·7H2O 0.001 g.

实验中使用的化学药品均为分析纯，其中(NH4)2SO4、MgSO4·7H2O、NaH2PO4、K2HPO4、NaCl、CaCl2、Fe2(SO4)3·7H2O 由生工生物工程（上海）股份有限公司提供；ZnCl2由西陇科学股份有限公司提供；CoCl2由上海新宝精细化工厂提供.

实验中使用的Kan 抗生素、琼脂糖、Marker 染料、蛋白胶试剂盒、IPTG 粉末、RNA 提取试剂、cDNA 反转录及qRT-PCR 试剂等均购置于生工生物工程（上海）股份有限公司.

1.1.3 仪 器

实验中使用的仪器：高速离心机（Eppendorf, Centrifuge5424），水平电泳仪（BIO-RAD,PowerPac Basic），垂直电泳仪（BIO-RAD, Mini-PROTEAN Tetra），凝胶成像仪（上海佳鹏，ZF-288），水平脱色摇床（江苏盛蓝，ZD-9556），RT-PCR 仪（罗氏，Lightcycler480）.

1.2 方 法

1.2.1 蛋白的诱导表达

在诱导表达时，接种重组大肠杆菌E.coliBL21(DE3)/AisZ-pET-28a(+)单菌落在含100 μg/mL Kan 抗生素的LB 培养基中培养过夜（12—16 h）；取1 mL 培养后的菌液，转接至100 mL 含Kan的LB 液体培养基中，37℃、200 rpm 震荡培养2.5—3 h，控制菌液的OD600在0.6 左右；加入0.1 mmol/L 的IPTG 混匀后，分别再加入0.2 mmol/L 的ZnCl2、CoCl2、CaCl2溶液[15]，18℃、低温诱导16 h，每4 h 取一次样，研究金属离子对诱导的影响.

1.2.2 SDS-PAGE 检测

取0.8 mL 诱导后的菌液加入0.2 mL 的Loading Buffer 混匀后，90°C 水中煮2—3 min，短暂离心取上清进行上样.电泳，上层胶采用的电压为90 V，下层胶采用的电压为150 V，待条带到胶底部时停止电泳.用考马斯亮蓝R250 染色3 h，用脱色液脱色至有清晰条带后观察.

1.2.3 生物传感器检测C6-HSL

报告紫色杆菌C.violaceumCV026 是一株mini-Tn5 突变株，自身无法产生信号分子，不能合成紫色素，但对外源信号分子具有敏感性，在接触到人工添加的信号分子后，会恢复紫色素的分泌[16]，其中它对C6-HSL 最为敏感，检测效果最好.

将C.violaceumCV026 单菌落接种于含100 μg/mL Kan 抗生素的LB 液体培养基，30℃、150 rpm 摇床培养6 h，控制OD600在1.0—1.2 之间.将LB 固体培养基加热，待温度冷却至50℃后加入Kan 抗生素，使培养基中抗生素终浓度为100 μg/mL，按10∶1 的体积比加入培养后的C.violaceumCV026 菌液，制成显色平板[17].

平板凝固后打孔，分别加入50 μL 1μmol/L、2 μmol/L、3 μmol/L、4 μmol/L、5 μmol/L、6 μmol/L、8 μmol/L 和 10 μmol/L 的C6-HSL，在30℃的培养箱正置培养，根据24 h 后C.ViolaceumCV026显色圈的直径绘制标准曲线[18].

取1 mL 诱导表达后的重组菌菌液加入9 mL 含10 μmol/L C6-HSL 的无机盐培养基中，在37℃、150 rpm 摇床中进行C6-HSL 降解反应，取1 mL 降解后的菌液于1 000 rpm 离心5 min，取上清液用0.22 μm 的微孔滤膜过滤，在显色平板中加入50 μL 处理后的滤液，在30℃的培养箱培养，显色后根据标准曲线计算降解率.

1.2.4 RNA 提取与RT-qPCR 检测

使用溶菌酶与Triozl 共同作用裂解细胞，提取诱导后重组菌的总RNA，并通过电泳检测RNA质量，电泳条件为90 V，25 min，超微量分光光度计测量RNA 浓度后，将Serratiasp.Z4 的RNA反转为cDNA，在RNase-free PCR 管中配置反应液，用移液器吹打混匀后放入PCR 仪进行反应，反应体系见表1，PCR 程序见表2.得到的cDNA 可以直接进行荧光定量PCR，或-20℃保存备用.

表1 反转录体系

表2 PCR 反应程序

根据aisZ 基因序列使用primer 5.0 软件设计引物5’-GAACAGTACGCCGCAGCAGATC-3’和5’-CAGATAAGCATTGACCGAGGTGACC-3’，内参基因为16S rRNA 蛋白质编码基因[19]，由生工生物工程（上海）股份有限公司进行合成.对aisZ的mRNA 表达量进行RT-qPCR 检测，RT-qPCR使用2 步法进行扩增，全程在超净台内进行，并使用96 孔板在冰上加样，每一组cDNA 模板需要分别加入内参引物和目的基因引物，每个组需要进行3 个重复，反应体系见表3.

使用罗氏荧光定量PCR 仪Lightcycler480 进行反应，首先95℃预变性3 min，接着95℃变性15 s，60℃延伸45 s，共进行35 个循环.在PCR 程序完成后，确认扩增曲线已经到达平台期，并根据达到荧光阈值的循环数计算Ct 值，Ct 值越小，证明模板中的靶基因含量越高，使用相对定量法中的2-△△Ct法[20]分析实验结果.

1.2.5 数据分析处理

所有试验均进行3 次生物学重复，使用SPSS 21.0 软件对实验结果进行统计学分析，并检验显著性（*P＜0.05，表示差异显著；**P＜0.01，表示差异极显著），用Origin 2022 软件进行绘图.

2 结 果

2.1 金属离子对蛋白诱导表达的影响

图1 为异源表达菌的SDS-PAGE 图，箭头标注的为目的蛋白AisZ，大小约35 kDa，CK 为未经诱导的蛋白条带，1—4 泳道分别为诱导4、8、12、16 h 后的蛋白条带.从图1（a）—图1（d）中都可看出，加入IPITG 溶液后，不论是否添加金属离子都可以成功使蛋白AisZ 诱导表达.从图1（b）—图1（d）中可以看出，加入金属离子，4 h 后可以初步看到蛋白条带，8 h 后条带明显可见，说明诱导时加入金属离子可能会使蛋白表达速度减慢，但在12 h 后的表达效果与不加入金属离子的效果相似，所以不能证明金属离子对蛋白的表达具有影响.为了进一步探究金属离子对淬灭酶AisZ 的作用，使用诱导后菌液对信号分子C6-HSL 进行降解，观察金属离子对酶活是否造成影响.

图1 不同金属离子对异源表达菌株中AisZ 表达的SDS-PAGE 图

2.2 金属离子对AisZ 降解效果的影响

绘制C.violaceum CV026 检测C6-HSL 浓度的标准曲线如图2 所示，图2（a）为1—10 μmol/L C6-HSL 的显色效果，图2（b）为拟合后的显色直径-浓度标准曲线，拟合公式为y= 0.662 22 +0.003 14x4.97898（R2= 0.996），可以直接将显色圈直径带入公式计算C6-HSL 的浓度及降解率.

图2 C.violaceum CV026 检测C6-HSL 浓度的标准曲线

在诱导时加入金属离子可以改变重组菌对C6-HSL 的降解效果（见图3），测量不同降解条件下的显色圈直径，并带入标准曲线，得到表5.从表5 可以看出，在37℃的条件下，诱导时未加入金属离子的重组菌，在前2 h 降解约40%的C6-HSL，4 h 降解约60%，6 h 后降解70%的C6-HSL，经过SPSS 分析证明该变化具有显著性（P＜0.05），且降解的效率随着剩余C6-HSL 浓度降低而减慢；而诱导过程中额外加入0.2 mmol/L CoCl2溶液后重组菌的降解效果有极显著提升（P＜0.01），2 h 可以降解约60%的C6-HSL，4 h 后降解80%的C6-HSL，6 h 就可以降解90%以上的C6-HSL，证明诱导时加入Co2+对重组菌中AisZ 的降解活性有积极的作用；相比于Co2+，Ca2+对重组菌的影响较小，几乎可以忽视，加入0.2 mmol/L 的CaCl2后，与只加入0.1 mmol/L IPTG 的对照组相比，降解率没有明显改变（P＞0.05）；而Zn2+则起了轻微的抑制作用（P＜0.05），这从图3（c）中也可明显看出，在降解6 h 后，加入了0.2 mmol/L ZnCl2的实验组，C.ViolaceumCV026显色圈直径大于未加入金属离子的对照组，说明Zn2+可能会抑制淬灭酶AisZ 的活性，使降解率从70.2%下降至55.6%，约下降了15%.

图3 AisZ 酶异源表达菌株在不同处理时间后对C6-HSL 的降解效果

表5 AisZ 酶异源表达菌株在不同处理时间后对C6-HSL 的降解效果（37℃）

2.3 金属离子对淬灭酶基因aisZ 表达量的影响

为了进一步探究金属离子对淬灭酶的影响，我们进一步通过提取异源表达菌的总RNA，来检验金属离子的加入是否会对淬灭酶AisZ 的mRNA 表达量造成影响.将提取的AisZ 异源表达菌中的总RNA 逆转录为cDNA 后进行RT-qPCR，以16S rRNA 蛋白质编码基因作为内参，探究诱导时金属离子对目的基因aisZ 表达量的影响.

结果（图4）表明，与只加入0.1 mmol/L IPTG 诱导的对照组相比，加入金属离子后目的基因aisZ 的表达量都降低了（30%—50%），其中额外加入0.2 mmol/L Co2+带来的降低最为明显，约下调了50%，加入Ca2+后aisZ 的表达量下调了40%.并且通过独立样本T 检验证明，加入金属离子后，虽然aisZ 表达量只发生轻微的下调，但与单独加入IPTG 后的对照组相比，这种变化具有显著性.这证明了诱导时加入金属离子不仅不能促进淬灭酶基因aisZ 的表达，甚至可能会起到抑制作用.

图4 金属离子对aisZ 基因表达量的影响

3 讨 论

本研究在AisZ 异源表达菌株经IPTG 诱导过程中加入金属离子，依次探究金属离子对淬灭酶AisZ 的影响，结果发现，在IPTG 诱导表达时加入0.2 mmol/L 的Zn2+或Ca2+或Co2+都会抑制淬灭酶基因aisZ的表达，但Co2+会提高淬灭酶AisZ 对C6-HSL 的降解效率，而Ca2+无明显影响，Zn2+则会抑制AisZ 的降解效果.我们认为，加入0.2 mmol/L Co2+，在淬灭酶基因aisZ表达量降低50%的基础上，依然可以使重组菌对C6-HSL 的降解效率在6 h 内提升接近30%，这是因为Co2+对淬灭酶AisZ 的降解活性具有一定的促进作用，但这种促进并不是靠提高淬灭酶基因aisZ的表达量来实现的，而可能是通过直接促进淬灭酶AisZ 自身的酶活而实现的.另外，加入Ca2+后，虽然没有直接提高AisZ 的降解效率，但在淬灭aisZ 的表达量下调40%的基础上，依旧能够保持原有的降解率，这也从侧面证明了Ca2+可以提高淬灭酶AisZ 的活性.Zn2+在使aisZ 表达量下调的情况下，对C6-HSL 的降解活性降低，并不能直接看出两者的关系，还需要经过试验进一步证明.

以上可能与淬灭酶AisZ 自身的性质相关.AisZ 属于MLL 家族，这是群体感应菌中的重要的淬灭酶家族，具有双金属结合位点[8,21]，它是一种金属依赖性水解酶，金属离子在很大程度上决定了酶的特性.在对MLL 家族中淬灭酶AidC 的研究中也发现金属离子会明显影响酶的淬灭活性，且不同金属离子会产生不同的效果[22].因此在酶诱导时添加不同的金属离子，可能会对淬灭酶AisZ 最终结合的金属离子产生影响，但其涉及到的机理还需要更多探究.

4 结 论

RT-qPCR 法分析结果表明，AisZ 异源表达菌株在IPTG 诱导表达时，加入0.2 mmol/L 的Zn2+或Ca2+或Co2+都会抑制淬灭酶基因aisZ 的mRNA 表达量；生物传感器检测表明，AisZ 异源表达菌株在IPTG 诱导表达时加入0.2 mmol/L 的Co2+会提高淬灭酶AisZ 对C6-HSL 的降解效率，而Zn2+则会抑制AisZ 的降解作用，Ca2+不会产生明显的影响.