一株产紫杉醇真菌的分离与鉴定

鹿孟云, 陈金凤, 马玉涵, 祝嫦巍*

(1.安徽科技学院 农学院,安徽 凤阳 233100;2.安徽科技学院 生命与健康科学学院,安徽 凤阳 233100)

紫杉醇(Paclitaxel),又称红豆杉醇、泰素等,是一种具有独特抗癌作用的二萜类化合物[1],已被广泛应用于乳腺癌、卵巢癌等癌症的治疗[2]。目前紫杉醇原料药主要是从红豆杉树皮中提取[3],然而红豆杉植物生长慢、不易繁殖,且紫杉醇的含量极低[4]。依靠红豆杉提取紫杉醇无法满足日益增长的市场需求,寻找其他途径解决原料药匮乏问题成为近年来的研究热点。

1993年,Stierle等[5]从红豆杉中分离出一株内生真菌,在半合成培养基中发现该菌能够独立合成紫杉醇,尽管产量很低,但也为紫杉醇原料药的生产提供了一条新的可能途径。随着研究范围的不断扩大,人们不仅从红豆杉及其近缘物种的内生真菌中分离获得具有紫杉醇合成能力的真菌[6-8],从其他非红豆杉植物中也分离获得具有产紫杉醇能力的真菌[9-11],说明产紫杉醇真菌在自然界可能广泛存在。从目前已报道的真菌的种属分布来看,产紫杉醇真菌也具有非常高的多样性。微生物的生长周期短,发酵条件易于控制,可能是解决紫杉醇原料药短缺问题的有效方法。

本研究以腐殖材料为研究对象,从枯败的植物材料中分离真菌,通过薄层色谱法、高效液相色谱法对其发酵液提取物进行分析,获得一株具有紫杉醇合成能力的菌株,并通过形态学和ITS序列分析对其进行初步鉴定。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 材料来源 以安徽科技学院校园内地表的各类枯败植物为材料。

1.1.2 培养基 马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)由200 g去皮马铃薯、20.0 g葡萄糖、1.5 g硫酸镁、3.0 g磷酸二氢钾、15.0～20.0 g琼脂、1 000 mL水组成,pH自然,121 ℃高压蒸汽灭菌20 min。马铃薯液体培养基(PDB)不添加琼脂,其他成分与PDA相同。

1.1.3 药品与试剂 紫杉醇标准品(北京索莱宝科技有限公司);真菌基因组DNA快速提取试剂盒(北京普鲁顿生物科技有限公司);琼脂糖,Taq DNA聚合酶,ITS引物(上海生工公司);二氯甲烷,色谱级甲醇(西陇科学股份有限公司);其他常规试剂均为国产分析纯。

1.1.4 主要仪器 Agilent 1260 Infinity高效液相色谱仪(安捷伦科技有限公司);ETC-811 PCR仪(东胜创新生物科技有限公司)。

1.2 试验方法

1.2.1 真菌的分离与纯化 收集材料,按常规方法分离微生物,待菌丝出现后,用无菌牙签挑取各平板上菌落边缘的菌丝接种于新的平板进行分离培养,25～28 ℃培养5～7 d。菌株连续传代5次以上,菌落形态稳定,初步纯化后,置于4 ℃保存。

1.2.2 产物的提取 菌株接种于100 mL PDB液体培养基中,26 ℃、160 r/min条件下培养7 d。在摇瓶内加入50 mL二氯甲烷充分萃取,有机相于旋转蒸发仪中旋转蒸干,2 mL无水甲醇溶解干燥物,0.22 μm微孔过滤后保存备用。

1.2.3 薄层色谱检测 使用GF254硅胶板,以紫杉醇标准品溶液为对照,采用V(三氯甲烷)∶V(乙腈)=9∶1作为展开剂,使用V(甲醇)∶V(浓硫酸)∶m(香草醛)=90 mL∶10 mL∶1 g作为显色剂,进行斑点显色,测量并计算斑点的Rf值。

1.2.4 高效液相色谱检测 使用Agilent 5 HC-C18(2)色谱柱,流动相为V(甲醇)∶V(水)=75∶25,流速0.5 mL/min,柱温25 ℃,紫外检测波长227 nm,进样量20 μL,根据样品与紫杉醇标准品的出峰时间进行对比。

1.2.5 菌株的形态观察 从培养数日的菌落上挑取少量的菌丝和孢子制成临时装片,置于光学显微镜下观察菌丝的形态、孢子形态以及孢子与营养体之间的着生关系,并进行鉴定。

1.2.6 ITS序列分析 以真菌基因组DNA为模板,进行ITS序列扩增。PCR反应体系为：0.5 μL模板,5 μL 10×Trans Taq-Buffer,4 μL dNTPs混合溶液,0.5 μL Taq酶,1 μL引物ITS1-F和1 μL ITS4,补水至50 μL。PCR扩增条件为94 ℃预变性5 min、94 ℃变性30 s、55 ℃退火30 s、72 ℃延伸1 min,共35个循环,72 ℃后延伸10 min,-20 ℃保存备用。引物合成和核酸测序由上海生工生物工程股份有限公司完成,测序结果在GenBank数据库中用Blast (https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)进行在线比对分析,使用软件MEGA 5.05进行聚类分析。系统发育树使用MEGA 5.0作图。

2 结果与分析

2.1 真菌的分离纯化与形态学观察

经多次分离纯化及产物鉴定,获得一株具有紫杉醇合成能力的真菌,将其命名为T20,其菌落形态特征如图1A、1B所示;菌落生长均匀,菌丝为白色,呈棉絮状,菌丝表面有孢子,背面白色,无色素沉积;孢子呈纺锤形(图1C),菌丝多分枝(图1D)。

图1 真菌T20菌株形态结构特征图Fig.1 Morphological and structural characteristics of fungus strain T20

2.2 真菌T20发酵产物薄层色谱检测

薄层层析的结果如图2所示,发酵液中的提取物与紫杉醇的标准品有相似的迁移率,Rf=0.14,说明发酵液中可能含有紫杉醇,将进一步进行高效液相色谱检测。

图2 紫杉醇标准品R和真菌T20发酵产物薄层层析图Fig.2 The thin layer chromatogram analysis of standard paclitaxel (R) and the extracted sample from fungus (T20)

2.3 真菌T20发酵产物高效液相色谱检测

高效液相色谱检测结果如图3所示,紫杉醇标准品的保留时间为12.570 min,真菌T20的发酵液提取物在12.597 min处出现较强的吸收峰,可视二者为同一物质,说明真菌T20在液体发酵培养过程中可以合成紫杉醇。

图3 真菌T20发酵产物高效液相色谱图Fig.3 High performance liquid chromatogram analysis of fungus T20 fermentation product

2.4 真菌T20的ITS序列扩增

利用真菌基因组DNA提取试剂盒对真菌T20进行DNA提取,以基因组DNA为模板,采用ITS1-F和ITS4做引物,进行PCR扩增,琼脂糖凝胶电泳结果如图4所示,扩增获得一条约为600 bp的DNA片段,将进一步进行测序分析。

图4 真菌T20 ITS序列PCR产物电泳图Fig.4 Agarose gel electrophoresis of ITS PCR product of fungus T20

2.5 真菌T20的ITS序列分析

将扩增后的DNA片段进行测序,测序由上海生工生物公司完成,结果在GenBank数据库中用Blast进行在线比对分析。结果显示,真菌T20与拟盘多毛孢属(Pestalotiopsis)的ITS序列同源性很高,相似度接近99%。选取相似性最高的10个序列进行发育树的分析,T20与其他菌株均不能聚为一类,如图5所示。

图5 真菌T20系统发育树分析Fig.5 Phylogenetic analysis of fungus T20 based on ITS sequences

3 结论与讨论

目前报道的产紫杉醇真菌主要是从红豆杉及其近缘物种的内生真菌中分离获得,而本研究意外地从腐殖材料中获得一株具有紫杉醇合成能力的真菌。经ITS序列分析,该菌与拟盘多毛孢属(Pestalotiopsis)真菌具有高度同源性。拟盘多毛孢是非常大的一类内生真菌[12],目前已报道有上百种,具有非常高的生物多样性[13],寄主范围也非常广[14]。本研究从腐殖材料中获得一株产紫杉醇真菌,说明该菌可能随着植物组织的老化脱离,从原来的内生状态重新返回大自然。目前已有多篇关于拟盘多毛孢属真菌产紫杉醇的报道[15-17],其宿主除了红豆杉及其近缘物种植物,也包括多种非红豆杉属植物。另外,Noh等[15]从红豆杉树林的泥土中分离得到一株异角状拟盘多毛孢菌(Pestalotiaheterocornis),该菌具有独立合成紫杉醇的能力,说明自然界中产紫杉醇真菌不一定以红豆杉及其近缘物种的内生真菌的形式存在,其寄主植物可以是红豆杉,也可以是其他植物,甚至以腐生的状态存在。

紫杉醇最早是从红豆杉树皮中分离获得,而产紫杉醇真菌最初也是从红豆杉的内生真菌中分离获得,因此人们建立了紫杉醇与红豆杉之间的关系。但随着研究的不断深入,人们发现了更多的非红豆杉来源的真菌产紫杉醇,且具有非常高的生物多样性,说明产紫杉醇真菌可能在自然界中广泛存在。本研究分离获得的真菌虽然属于著名的内生真菌,但却是从腐殖材料中分离获得,同时与红豆杉植物之间没有任何关系,这无疑为产紫杉醇真菌的发现提供了新的途径和思路。ITS序列分析显示,该菌与目前已知的拟盘多毛孢属真菌均不能聚为一类,体现了物种多样性,以及与生态之间的关联。真菌的生长速度快,发酵周期短,已经成为解决紫杉醇原料药短缺的可能有效途径,因此寻找更多的产紫杉醇真菌资源具有非常重要的研究意义和应用价值。