血清LDH、TIMP1、BLC、Eotaxin2预测骨髓增殖性肿瘤患者骨髓纤维化程度的效能*

陈禾惠,王冲,陈朴,于正麟,马艳婷,陈楠,潘柏申,王蓓丽,郭玮(复旦大学附属中山医院检验科,上海 200032)

骨髓增殖性肿瘤(myeloproliferative neoplasms,MPN)作为一种慢性迁延性疾病,确诊患者需长期随访,监测进展[1]。骨髓纤维化(myelofibrosis, MF)是MPN发生、发展过程中最主要的并发症之一,严重影响患者的生存质量及预后,故而早期发现纤维化并及时干预意义重大。目前骨髓纤维化诊断主要依赖于骨髓活检,但是骨髓穿刺创伤性大,患者依从性较差,且临床表现较为隐匿,部分患者因错过最佳的干预时机导致预后较差,这进一步凸显了筛选便捷、可靠的血清学预测指标的迫切性及重要性。

近年来研究表明,炎症与MPN发生、发展密切相关。本课题组前期通过细胞因子芯片技术检测发现MPN患者血浆中的金属蛋白酶组织抑制剂1(the tumor inhibitor of metalloproteinase 1, TIMP1)、B淋巴细胞趋化因子(B-lymphocyte chemoattractant,BLC)、嗜酸性粒细胞趋化因子2(Eotaxin2)、巨噬细胞集落刺激因子(macrophage-stimulating factor, M-CSF)及可溶性细胞间黏附分子(soluble intercellular adhesion molecule-1, sICAM-1)均显著高于健康人对照组,且与其在骨髓上清中的表达水平具有良好的相关性,可作为潜在的分子靶标[2]。既往研究[3-5]表明,TIMP1、BLC及Eotaxin2在肺、肝等多种组织器官的纤维化进程中具有促进作用。此外,作为MPN重要的血清学预后评估指标,乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)在MPN患者中与肿瘤负荷密切相关[6-7]。因此,本研究通过对MPN患者的上述血清学指标进行检测,探索其在骨髓纤维化进展及监测中的作用。

1 材料与方法

1.1研究对象 收集2017年7月至2018年12月于复旦大学附属中山医院血液科确诊为费城染色体阴性(Philadelphia-nagetive,Ph-)MPN患者40例,男24例,女16例,年龄(59.8±10.2)岁。包括真性红细胞增多症(polycythemia vera,PV)9例、原发性血小板增多症(essential thrombocythemia,ET)15例和原发性骨髓纤维化(primary myelofibrosis,PMF)16例。纳入标准:根据世界卫生组织(WHO)2016年BCR-ABL阴性MPN诊断标准[8]确诊为MPN且伴有JAK2V617F,JAK2EXON12,MPLW515L/K,CALR等突变。排除标准:(1)Ph或BCR-ABL融合基因阳性;(2)确诊前接受过临床治疗;(3)伴有其他血液疾病或其他纤维化疾病;(4)研究资料不完整。根据WHO 2016年骨髓纤维化分级标准[8]分为纤维化前/早期组(MF-0和MF-1级)24例,明显纤维化期组(MF-2和MF-3级)16例。另选取同期体检健康者20例作为健康人对照组,其中男10例,女10例,年龄(56.9±5.6)岁。MPN患者及健康人对照组间的性别(χ2=1.497,P>0.05)、年龄(t=1.184,P>0.05)差异均无统计学意义。本研究获得复旦大学附属中山医院医学伦理委员会批准(批准文号:B2022-516R),患者及家属知情同意。

1.2样本采集 采集MPN患者治疗前(体检健康者于体检时采集)的空腹外周静脉血5 mL于含二氧化硅及分离胶的真空采血管中,待自然凝固后,1 500×g离心10 min,分离血清1 mL于离心管中,其余血液样本置于-80 ℃保存。

1.3仪器与试剂 cobas c702全自动生化分析仪及配套的LDH试剂盒(瑞士罗氏公司),RayBio®人TIMP1/Eotaxin2/BLC ELISA试剂盒(美国RayBiotech公司),ST-360酶标仪(上海科华生物公司),TS-1脱色摇床(海门市其林贝尔公司),Sysmex XN-9000全自动血细胞分析仪及配套的血常规检测试剂(日本希森美康公司)。

1.4血清TIMP1、Eotaxin2、BLC水平检测 基于ELISA法,按照RayBio®人TIMP1/Eotaxin2/BLC ELISA试剂盒及说明书操作,通过ST-360酶标仪读取吸光度(A)值并绘制标准曲线,计算各组血清TIMP1、Eotaxin2、BLC的浓度。TIMP1参考区间:40～18 000 pg/mL,Eotaxin2参考区间:2～1 000 pg/mL,BLC参考区间:1.5～1 000 pg/mL。

1.5血清LDH测定 基于速率法,按照cobas c702全自动生化分析仪及配套的LDH试剂盒说明书操作检测各组血清LDH水平。LDH参考区间:109.0～245.0 U/L。

1.6红细胞(RBC)、血小板(PLT)、血红蛋白(Hb)测定 按照Sysmex XN-9000全自动血细胞分析仪及配套的血常规检测试剂说明书操作,基于电阻抗法检测参数RBC和PLT,基于光电比色法检测Hb水平。RBC参考区间:(4.3～5.8)×1012/L,PLT参考区间:(125～350)×109/L,Hb参考区间:130～175 g/L。

2 结果

2.1各组血清学及血常规指标比较结果 MPN患者血清LDH、TIMP1、BLC、Eotaxin2水平及PLT显著高于健康人对照组,但RBC、Hb在两组之间的差异无统计学意义。见表1。进一步进行亚组间的分析结果表明,明显纤维化期组患者血清LDH、TIMP1显著高于纤维化前/早期组,而血清BLC、Eotaxin2及RBC、Hb、PLT在两组之间的差异无统计学意义。见表2。

表1 MPN组及健康人对照组血清学及血常规指标比较结果

表2 纤维化前/早期组与明显纤维化期组血清学及血常规指标比较结果

2.2各指标的相关性分析结果 MPN患者血清TIMP1、BLC、Eotaxin2水平与RBC、Hb、PLT均无相关性(P>0.05),而血清LDH与RBC(r=-0.353 6,P=0.025 2)、Hb(r=-0.505 7,P=0.000 9)呈负相关性。进一步进行Spearman相关性分析结果发现,血清LDH(r=0.588 6,P<0.000 1)、TIMP1(r=0.482 4,P=0.001 6)、BLC(r=0.315 8,P=0.047 1)与MPN患者MF分级呈正相关性。见表3。

表3 MPN患者血清学指标与血常规指标及MF分级的相关系数(r)

2.3血清学指标对MPN患者骨髓纤维化的预测效能分析 选取在纤维化前/早期组与明显纤维化期组间差异最为显著的LDH、TIMP1,通过二元Logistic回归分析二者联合预测因子的计算公式:LDH、TIMP1联合预测因子=0.004×TIMP+10.008×LDH-8.153。以纤维化前/早期组为对照组,明显纤维化期组为疾病组,绘制ROC曲线并评估各指标对MPN患者骨髓纤维化程度的预测价值,结果发现血清LDH、TIMP1单独及二者联合预测因子对MPN患者骨髓纤维化程度预测效能较佳,而血清BLC、Eotaxin2预测效能较差(P>0.05)。见图1、表4。

图1 血清LDH、TIMP1单独及二者联合预测骨髓纤维化程度的ROC曲线

表4 血清学指标在MF分级鉴别中的价值

3 讨论

骨髓纤维化是MPN患者疾病进展过程中的严重不良事件,目前临床上缺乏有价值的骨髓纤维化筛查的血清学标志物。本研究结果显示,MPN患者血清TIMP1、BLC、Eotaxin2及LDH的表达水平显著高于健康人对照组,明显纤维化期组血清LDH、TIMP1的表达水平显著高于纤维化前/早期组。结合ROC曲线分析提示,LDH、TIMP1单独及二者联合预测因子具有作为骨髓纤维化进展辅助筛查标志物的潜能。

本研究结果还发现,血清LDH、TIMP1、BLC、Eotaxin2在MPN患者中呈高表达,且LDH、TIMP1与MF分级呈正相关。Wang等[9]研究证实,TIMP1在MPN患者血清中的表达水平升高,引起基质蛋白合成与降解平衡紊乱,导致纤维化发生,与本研究结果相一致。Murate等[10]发现, MPN患者TIMP1水平升高且与PLT呈正相关,并证实TIMP1与来源于骨髓内异常增殖的巨核细胞和血小板有关,从而进一步促进骨髓纤维化形成。本研究发现血清TIMP1与PLT无明显相关性,分析原因可能是由于纳入患者的地域不一致所致,有待进一步扩大样本量进行探究。LDH是MPN预后判断的重要指标,Zulkeflee等[11]发现LDH在MPN患者血清中升高,并证实与患者肿瘤细胞恶性增殖程度呈正相关。本研究结果亦证实,LDH水平升高与患者贫血、骨髓纤维化进展有关,和Shah等[12]发现的LDH水平升高与MPN患者不良事件的发生密切相关结果相一致。另有研究证实,BLC、Eotaxin2升高在促进肺、肝等纤维化进展中具有重要作用[4-5]。笔者发现BLC、Eotaxin2在MPN患者中的表达水平升高,但与骨髓纤维化严重程度无关,分析原因可能是由于纤维化组织类型的差异造成,但仍需进一步的实验证实。

本研究进一步通过ROC曲线分析发现,血清LDH、TIMP1在MPN患者骨髓纤维化进展中具有较高的预测价值。目前针对骨髓纤维化进展监测的血清学标志物研究较少,仅Yokus等[13]发现60岁以上MF患者血清铁蛋白水平与MF分级呈正相关。笔者发现血清LDH、TIMP1可以预测MPN患者的骨髓纤维化严重程度,这与既往研究中证实的LDH、TIMP1在肺、肝纤维化诊断和预测中的作用基本一致[14]。本研究还发现二者联合应用的预测效能更佳,故而建议对血清LDH、TIMP1联合预测因子升高的MPN患者,及时给予干预,抑制骨髓纤维化的进展,提高患者预后生存状态。

本研究尚存在一定的局限性。首先,本研究入组样本量偏小,且为单中心研究,后续研究中需扩充样本量,并进行多中心研究,以评估其对MPN骨髓纤维化程度的预测效能;其次,本研究未对MPN各亚型间进行相关指标的比较,其在MPN亚型鉴别诊断中的价值有待进一步研究。