miRNA-221-3p和IGF-1在妊娠期糖尿病患者血清中的表达及与妊娠结局的相关性*

2023-06-04 11:30丁玉重文彩玲牛凤鹤濮阳市妇幼保健院孕产保健部河南濮阳457000南阳市第二人民医院妇科河南南阳473000
临床检验杂志 2023年3期
关键词:健康人靶向试剂盒

丁玉重,文彩玲,牛凤鹤(.濮阳市妇幼保健院孕产保健部,河南濮阳 457000;.南阳市第二人民医院妇科,河南南阳 473000)

近年来,妊娠期糖尿病(gestational diabetes mellitus, GDM)发生率呈逐年上升趋势,其可引发产后出血、胎儿窘迫等不良妊娠结局[1-2]。因此,寻找与GDM发病有关的指标,及时干预,对改善GDM妊娠结局有积极意义。研究发现,微小RNA-221(microRNA-221, miR-221)作为miRNA的一员,参与了GDM病理变化,其在GDM患者中呈低表达,miR-221可能通过影响胰岛功能,进而影响GDM的发生、发展[3]。Gan等[4]发现miR-221-3p是miR-221家族的一员,其可靶向调控胰岛素样生长因子-1(insulin-like growth factor-1, IGF-1)表达。Balachandiran等[5]发现IGF-1在GDM患者中的表达水平升高,且证实IGF-1可能影响胎儿生长。但miR-221-3p在GDM患者中的表达水平及其与IGF-1、妊娠结局的关系目前尚不明确。因此,本研究通过测定miR-221-3p在GDM患者血清中的表达水平,以期探究miR-221-3p与IGF-1、妊娠结局的关系。

1 资料与方法

1.1临床资料 选取2020年5月至2022年5月在濮阳市妇幼保健院孕产保健部足月分娩的血糖控制良好的GDM患者80例为GDM1组,产妇年龄为(28.6±4. 6)岁,BMI为(25.30±3.01)kg/m2;另选取同期足月分娩的血糖控制不良的GDM患者80例为GDM2组,产妇年龄(29.3±4.8)岁,BMI为(25.67±3.18)kg/m2。纳入标准:(1)GDM1组、GDM2组患者均符合《妊娠期糖尿病诊治指南》[6]中GDM的判定标准;(2)GDM1组患者FPG<5.3 mmol/L,进餐后1 h时血糖水平<7.8 mmol/L,2 h时血糖水平<6.7 mmol/L为血糖控制良好,GDM2组患者不符合上述标准记为血糖控制不良;(3)受试者对本研究知情同意,均为单胎妊娠;(4)受试者检查资料完善;(5)足月分娩。排除标准:(1)孕前有糖尿病史者;(2)合并冠心病、高血压等心血管疾病者;(3)患有多囊卵巢综合征者;(4)合并肝肾功能障碍者;(5)使用激素类药物或因其他因素引起血糖升高者。纳入同期足月分娩的糖代谢正常的健康孕妇80例为健康人对照组,产妇年龄为(28.9±4.7)岁,BMI为(25.54±3.09)kg/m2。健康人对照组、GDM1组、GDM2组年龄、孕周比较差异均无统计学意义(P>0.05)。本研究符合《赫尔辛基宣言》,且经濮阳市妇幼保健院医学伦理委员会批准(批准文号:202004005)。

1.2方法

1.2.1主要仪器及试剂 TaqManTMmiRNA ABC纯化试剂盒和TaqManTMAdvanced miRNA cDNA合成试剂盒(美国Invitrogen公司),miRNA qRT-PCR Kit(美国默克公司),人IGF-1 ELISA试剂盒(上海远慕生物科技公司)。MyGo Pro qRT-PCR仪(英国IT-IS公司),UV1700紫外分光光度计(上海奥析科学仪器公司),BS-600M全自动生化分析仪(深圳迈瑞医疗公司),MultiskanFC酶标仪(美国Thermo Fisher公司)。

1.2.2样本收集 留存所有受试孕妇在孕24~28周的空腹外周血4~5 mL,静置45 min,4 800 r/min离心5 min,分离上清液(血清),分装并保存于-80 ℃冰箱。

1.2.3检测指标 收集所有受试者年龄、体质量指数(BMI)、总胆固醇(TC)、舒张压、三酰甘油(TG)、收缩压、低/高密度脂蛋白胆固醇(LDL-C/HDL-C)、产后出血、羊水过多、胎膜早破、巨大儿、胎儿窘迫、空腹胰岛素(FINS)、空腹血糖(FBG)等临床资料,其中血清指标TC、TG、LDL-C/HDL-C、FINS和FBG均使用BS-600M全自动生化分析仪及相应的试剂盒检测,在检测前使用校准品、质控品对仪器进行定标质量控制,根据稳态模型公式:胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)=FINS×FBG/22.5,计算HOMA-IR。

1.2.4实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测血清miR-221-3p表达水平 解冻血清,按照TaqManTMmiRNA ABC纯化试剂盒说明书提取血清miRNA,使用UV1700紫外分光光度计检测cDNA/RNA的浓度和纯度,取吸光度(A260 nm/A280 nm)值在1.8~2.0之间,浓度>25 ng/μL的样本,采用TaqManTMAdvanced miRNA cDNA合成试剂盒进行逆转录反应,cDNA 样本置于-80 ℃保存。miR-221-3p以U6为内参,引物由上海生工公司合成,并采用Primer Express 3.0软件设计。miR-221-3p上游引物序列:5′-GGCATGAACCTGGCATACAA-3′;下游引物序列:5′-TTTCCAGGTAGCCTGAAACCC-3′,GenBank序列号为NC_000023.11,退火温度为53 ℃,产物片段大小124 bp;U6上游引物序列:5′-CTCGCTTCGGCAGCCACA-3′;下游引物序列:5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′,GenBank序列号为NC_015438.3,退火温度为58 ℃,产物片段大小106 bp。按照miRNA qRT-PCR Kit及MyGo Pro qRT-PCR仪说明书进行cDNA扩增,于72.5 ℃时采用仪器自带软件QuantStudio RT-PCR Software收集荧光信号并进行熔解曲线分析,检测并计算基因循环阈值(Ct)。PCR反应体系:PCR Master Mix 20 μL,10 μmol/L上、下游引物各0.5 μL,cDNA模板2 μL,ddH2O补足至20 μL。循环参数:98.2 ℃ 8 min;97.5 ℃ 30 s,56.5 ℃ 20 s,72.5 ℃ 15 s,共40个循环。miR-221-3p相对表达量以2-ΔΔCt法计算。ΔΔCt=(ΔCt实验组-ΔCt健康人对照组),ΔCt=Ct目的基因-Ct内参基因。

1.2.5ELISA法检测血清IGF-1水平 按照人IGF-1 ELISA试剂盒说明书配制IGF-1的标准品溶液,解冻血清,采用MultiskanFC酶标仪检测IGF-1标准品溶液及待测血清在波长450 nm处的吸光度(A)值,绘制IGF-1标准曲线并计算血清IGF-1水平。

1.2.6生物信息学预测miR-221-3p与IGF-1的关系 采用Starbase生物信息学网站(https://starbase.sysu.edu.cn/)预测miR-221-3p与IGF-1的关系。

2 结果

2.1各组一般资料的比较结果 仅FBG、FINS及HOMA-IR在3组间的表达水平差异有统计学意义(P<0.05)。进一步行组间两两比较结果发现,与健康人对照组相比,GDM1组、GDM2组患者FBG、FINS、HOMA-IR水平升高(P<0.05);而与GDM1组相比,GDM2组患者FBG、FINS、HOMA-IR水平升高(P<0.05);3组在年龄、体重指数、TC、TG、舒张压、LDL、收缩压、HDL水平比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。见表1。

表1 各组一般资料的比较结果

2.2各组血清miR-221-3p、IGF-1水平比较 血清miR-221-3p、IGF-1水平在3组间的表达水平差异均具有统计学意义(F分别为244.293和430.142,P<0.01);进一步进行组间两两比较结果表明,与健康人对照组相比,GDM1组、GDM2组患者血清miR-221-3p的表达水平降低(P<0.05),而IGF-1的表达水平升高(P<0.05);此外,与GDM1组相比,GDM2组患者血清miR-221-3p的表达水平降低(P<0.05),而IGF-1的表达水平升高(P<0.05)。见表2。

表2 各组血清miR-221-3p、IGF-1水平比较

2.3GDM患者血清miR-221-3p、IGF-1水平与FBG、FINS、HOMA-IR的相关性 Pearson法分析显示,GDM1组和 GDM2组患者血清miR-221-3p的表达水平与FBG、FINS、HOMA-IR均呈负相关(P<0.05),IGF-1水平与FBG、FINS、HOMA-IR均呈正相关(P<0.05)。见表3和表4。

表3 GDM1组患者血清miR-221-3p、IGF-1水平与FBG、FINS、HOMA-IR的相关性

表4 GDM2组患者血清miR-221-3p、IGF-1水平与FBG、FINS、HOMA-IR的相关性

2.4各组不良妊娠结局比较 与健康人对照组相比,GDM1组、GDM2组产后出血、羊水过多、胎膜早破、巨大儿、胎儿窘迫发生率显著升高(P<0.05);此外,与GDM1组相比,GDM2组产后出血、羊水过多、胎膜早破、巨大儿、胎儿窘迫发生率显著升高(P<0.05)。见表5。

表5 各组不良妊娠结局比较[n(%)]

2.5GDM患者血清miR-221-3p、IGF-1水平与妊娠结局的相关性 与未发生产后出血、羊水过多、胎膜早破、巨大儿、胎儿窘迫的GDM患者相比,发生以上不良妊娠结局的GDM患者血清miR-221-3p的表达水平显著降低(P<0.05),而IGF-1的表达水平显著升高(P<0.05)。见表6。

表6 不同妊娠结局GDM患者血清miR-221-3p、IGF-1水平比较

2.6GDM患者血清miR-221-3p与IGF-1水平的相关性 Pearson法分析结果显示,GDM1组与GDM2组患者血清miR-221-3p与IGF-1水平均呈负相关(r分别为-0.502,-0.415,P<0.05)。Starbase生物信息学分析结果显示,miR-221-3p与IGF-1存在靶向结合位点。见图1。

图1 生物信息学分析miR-221-3p与IGF-1的靶向结合位点

3 讨论

miR-221-3p通过与靶基因结合促进糖尿病伤口愈合,可作为治疗糖尿病足溃疡的潜在靶点[7]。另外,miR-221在2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus, T2DM)中的表达水平降低,且与HOMA-IR呈负相关,可能参与T2DM病理进展[8]。研究表明,IGF-1可维持血糖水平,影响血管新生,调节滋养细胞浸润,参与滋养细胞植入子宫蜕膜,调控胎儿生长发育,与妊娠结局关系密切[9-10]。既往报道显示,IGF-1在GDM患者胎盘组织中的表达水平升高,可影响新生儿免疫功能,可能参与并影响GDM病变过程[11]。另外,何勤燕等[12]研究发现,IGF-1在GDM患者中呈显著高水平,且与巨大儿显著有关,可能会增加新生儿异常发生率。还有学者发现, miR-221-3p可靶向调控IGF-1[4]。本研究中,GDM1组、GDM2组患者血清miR-221-3p的表达水平显著低于健康人对照组,且GDM2组低于GDM1组;而血清IGF-1水平显著高于健康人对照组,且GDM2组高于GDM1组,提示miR-221-3p和IGF-1可能参与了GDM发病过程,推测miR-221-3p通过靶向调节IGF-1,影响信号转导,调控胰岛β细胞的增殖、凋亡,进一步影响胰岛功能,从而促进胰岛素分泌,在GDM病变过程中起重要作用[13]。GDM患者体内存在血糖紊乱,本研究显示,健康人对照组、GDM1组、GDM2组FBG、FINS、HOMA-IR的表达水平逐渐升高,与孙露阳等[8]研究结果类似,且GDM2组患者血清FBG、FINS、HOMA-IR水平显著高于GDM1组患者,GDM1组和GDM2组患者血清FBG、FINS、HOMA-IR与miR-221-3p水平均呈负相关,而与IGF-1水平呈正相关,提示miR-221-3p和IGF-1可能与GDM患者的胰岛细胞功能显著相关,进一步证实了血清miR-221-3p水平随胰岛素分泌增加而降低,而IGF-1水平随胰岛素分泌增加而增加。

另外,本研究还发现GDM2、GDM1组不良妊娠结局发生率高于健康人对照组,且GDM2高于GDM1组,表明GDM可能使不良妊娠结局发生率增加,且血糖控制不良可能导致不良妊娠结局发生风险更高。进一步研究显示,miR-221-3p在产后出血,羊水过多、胎膜早破、巨大儿、胎儿窘迫一系列不良妊娠结局的GDM患者血清中的表达水平显著降低,而IGF-1在不良妊娠结局的GDM患者血清中的表达水平升高,提示miR-221-3p和IGF-1可能与GDM不良妊娠结局密切相关,推测miR-221-3p通过调控IGF-1,调节胰岛素功能,影响胰岛素分泌,引起糖代谢紊乱,进而影响GDM患者妊娠结局,但具体机制仍需进一步探讨。此外,经Pearson相关性分析发现,GDM1组、GDM2组患者血清miR-221-3p与IGF-1水平均呈负相关;生物信息学检索分析显示,miR-221-3p与IGF-1存在靶向结合位点,提示miR-221-3p可能与IGF-1靶向结合,进而影响糖代谢及GDM的病理进展。但本研究尚未通过荧光素酶报告基因检测等试验进一步验证miR-221-3p、IGF-1的关系,且未能深入探究GDM患者分娩前后血清miR-221-3p、IGF-1水平的动态变化以及未进一步分析影响GDM患者妊娠不良结局最紧密的指标,此为本研究不足之处。后续笔者将进一步增加样本量,通过多元Logistic回归及ROC曲线分析深入探究miR-221-3p和IGF-1对GDM患者妊娠结局的影响,并进一步分析二者关系,探究其影响GDM患者妊娠结局的作用机制,为将miR-221-3p、IGF-1水平作为GDM患者预测妊娠结局指标提供更充分的试验依据。

综上所述,GDM患者血清miR-221-3p的表达水平降低,而IGF-1的表达水平升高,且证实二者均与产后出血、羊水过多、不良妊娠结局有关,表明miR-221-3p可能与IGF-1共同影响GDM患者的妊娠结局,为临床诊治GDM,降低不良妊娠结局发生率提供一定实验指导。

作者贡献声明:丁玉重负责实验操作,论文撰写;文彩玲负责数据整理,统计学分析;牛凤鹤负责论文修改,经费支持。所有作者声明无利益冲突。

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