马巴贝斯虫病的检测技术研究进展

刘 誉，吴锦顺，潘 娟

（1.天津国际旅行卫生保健中心 天津海关口岸门诊部，天津 300450；2.珠海国际旅行卫生保健中心 拱北海关口岸门诊部，广东 珠海 519000）

马巴贝斯虫是一种血液寄生虫，可由蜱传播给马、驴、骡和斑马，它感染马属动物的红细胞和淋巴细胞［1］。国外学者通过染色血片检查、实验动物分离虫种和血清学方法检查，对已发现的22 例人巴贝斯虫病例的病原学进行了分析，发现已知的人巴贝斯虫是来源于家畜和野生动物的4 种巴贝斯虫：牛巴贝斯虫、马巴贝斯虫、分歧巴贝斯虫和田鼠巴贝斯虫［2］。感染马巴贝斯虫后，可引起一种血液原虫病，通常把它叫作马巴贝斯虫病［3-4］。

马巴贝斯虫病的临床症状通常表现为发热、贫血、黄疸［1，3，5］，病马较瘦弱。该病可发生最急性、急性和慢性病例，急性病例特征是高热、黏膜充血、呼吸脉搏加速［4］，急性病例通常导致持续的、长期感染［3］，严重可导致死亡［4］；慢性病例在临床上通常呈现非特征性症状，如食欲不振，动作迟缓，体重下降，直肠检查常可发现脾肿大［4］。最急性病例比较少见，到发现时病马已死亡或者濒临死亡［5］。马巴贝斯虫病广泛分布于世界各地［6］。

马巴贝斯虫为许多进出口马属动物国家要求的法检项目［7-8］，在进出口马属动物双边协议中都要求检测马巴贝斯虫。国际动物卫生组织将马巴贝斯虫病列为B 类动物疾病［4］。在我国，农业部将其定为二类动物疾病［6］。

南非新近调查证明，马的巴贝斯虫病是一种严重传播性疾病，年发率为1.88%，近10 000 匹马，两个虫种在南非对易感马的致死率均在10% 以上，有时接近50%。在中国，黑龙江、内蒙古、吉林、青海等省发病较严重，平均死亡率为11.9%，严重地区达14.6%［6］。

由于马巴贝斯虫危害大，难以根治，对国际马匹贸易产生很大影响［8］，因此各国都将该寄生虫列为重要监测的马病之一。

马巴贝斯虫病虽然主要是在马属动物之间流行，但人偶尔可能感染，是一种人畜共患病。受感染的机会与蜱虫叮咬密切相关。因此，到流行地区旅游或野外作业的人群有被感染的危险。切除脾脏者更易感染。随着人与马属动物接触的机会越来越多，人感染巴贝斯虫的报道也越来越多。人感染巴贝斯虫的症状主要有发冷，发热，精神不振，厌食，黄疸，溶血性贫血等症状［2］。

马巴贝斯虫感染马属动物后因不产生明显的临床症状，因此主要依靠实验室检测进行诊断。目前主要有病原学、血清学、分子生物学和生物学试验等检测技术。

1 镜检法

马巴贝斯虫的感染可以通过血液或组织染色涂片的虫体检查来诊断，如姬姆萨染色［9］，通常能获得最好的效果。采用厚膜血液涂片技术，有时也可查到虫体［10］。取一小滴血液置于洁净的载玻片上，自然干燥，80℃加热固定5 min，用5% 姬姆萨染色液染色20～30 min，显微镜下观察结果。血涂片的方法简单易行，结果易于判定，但是其阳性检出率极低，对于低水平虫血症尤为困难［1］。目前，这种方法已经较少在实际工作中应用。

2 血清学检测技术

在血清学检测方法中应用较多的为补体结合试验、间接免疫荧光试验、酶联免疫吸附试验、免疫胶体金试验。

2.1 补体结合试验（CFT）

Hirato 等［11］最早研究采用CFT 检测马巴贝斯虫。Frerichs 等［12］对CFT 抗原的制备方法进行了研究，其建立的CFT 在一些国家中被作为进口马检疫的首选试验［13］，该方法在虫血症高峰期收集抗原，以溶血系统作为指示系统，测定血清效价达1∶5 时为阳性，可以特异性地针对马巴贝斯虫进行诊断。由于CFT 的诊断准确性和敏感性较好，因而一直作为国际贸易指定试验。CFT 分为常量法［6］和微量法［4，14］。但是，CFT 有3 个问题无法解决：一是存在抗补体反应的血清不能用CFT 检测，二是与CFT 对照红细胞抗原发生反应的血清不能用CFT 检测，三是因为在经典CFT 方法IgG（T）不结合补体，所以含有特殊IgG（T）抗体的血清可产生假阴性结果［15］。

2.2 间接免疫荧光试验（IFA）

间接免疫荧光试验已成功用于马巴贝斯虫鉴别诊断［5，16］。该试验是将待检血清从1∶80 依次稀释为1∶1 280，加于抗原玻片上，再加入荧光素标记的兔抗马IgG，经过孵育和洗涤，在荧光显微镜下寻找发荧光的虫体。

IFA 较CFT 更早些检出马巴贝斯虫阳性抗体，且持续检出抗体的时间比CFT 长，当CFT 检测已转为阴性时，IFA 仍能检出为阳性。因此Tenter 等［17］建议CFT 与IFA 试验结合使用以便安全鉴别马巴贝斯虫感染。

而另一方面，虽然IFA 试验对强阳性反应的判定较简单，但对界于弱阳性和阴性反应之间的鉴别，则比较困难，容易误判。因此，目前IFA 试验仍是作为CFT 的辅助试验，用于对发生抗补体反应的血清的检测，主要为一些驴血清。而不作为官方试验或贸易指定试验［4］。

2.3 酶联免疫吸附试验（ELISA）

ELISA 因其快速、敏感、特异的特点，一直是被作为检测马巴贝斯虫的理想方法进行研究。

最早，Gota［18］和Merkle［19］曾报道采用ELISA 可检测出实验感染马的马巴贝斯虫抗体。

1991 年Knowles 等［15］成功地将马巴贝斯虫裂殖子抗原1（EMA-1）重组蛋白和单克隆抗体Mab36/133.97［20］应用于竞争ELISA（C-ELISA）。其原理是含有马巴贝斯虫抗体的血清与包被的EMA-1 重组蛋白特异地结合，抑制Mab36/133.97与重组蛋白结合，从而影响了单抗与结合物的结合，导致不产生颜色反应或很少颜色反应。该CELISA 解决了补体结合试验存在的3 个问题。用C-ELISA 和CFT 对来自19 个国家的154 份血清进行马巴贝斯虫抗体检测，结果符合率为94%（144份）。不符合的10 份血清中有5 份经免疫沉淀反应证实结果与C-ELISA 相符。154 份血清中有16份驽巴贝斯虫（Babesia caballi）CFT 阳性的样品，经C-ELISA 检测为阴性，这些数据表明，C-ELISA 对马巴贝斯虫是有特异性的。

Huang 等［21］将编码马巴贝斯虫裂殖子抗原-2（EMA-2t）片段的基因克隆，并在大肠杆菌中高表达为谷胱甘肽S 转移酶融合蛋白（G-rEMA-2t）。GrEMA-2t 有很好的抗原性。用G-rEMA-2t 做酶联免疫吸附试验（ELISA）能清楚地区别开实验感染马巴贝斯虫的马血清和感染驽巴贝斯虫的马血清以及健康马血清。在感染的急性期和潜伏期（感染后6～244 d）在感染马巴贝斯虫的马体内都能检测到特异性抗体。结果表明G-rEMA-2t 适合于用作有效的免疫学诊断方法的抗原，因为它们具有高的敏感性、特异性和高的产出量。

Kumar 等［22］曾用马巴贝斯虫全裂殖子（WM）抗原做ELISA 试验，结果显示WM 抗原不仅具有针对阴性血清较高预估值且其敏感性最强，而且其它马病感染的阳性血清包括驽巴贝斯虫，在ELISA 方法上显示与WM 抗原无交叉反应，因此该试验具有免疫学特异性。109 份未知的野外驴/马血清的抗体滴度用WM 抗原做ELISA 检测，结果显示该方法具有经济、方便、敏感、特异等特点，适合用于野外马巴贝斯虫感染血清流行病学的研究。

近年来，日本学者［23-25］研究用马巴贝斯虫特异性基因片段产物作为ELISA 抗原检测马巴贝斯虫。通过抽提感染马巴贝斯虫的阳性马的总mRNA，构建马巴贝斯虫cDNA 文库，并在噬菌体展示文库中进行表达，与阳性马巴贝斯虫血清进行反应，获得免疫抗原，并对其进行测序，同NCBI 提供的基因库进行比对，最终确定该基因来自马巴贝斯虫，到目前为止，他们共获得了2 个新的抗原蛋白，一个大小为82 kd，命名为Be82；一个大小为158 kd，命名为Be158。

以Be82［23］为抗原的ELISA 检测，可以检出全部自然感染的阳性马血清；对实验感染马的检测发现，可以在感染后12～18 d 检出。以上的实验是在小样本范围内进行的，因而还需进一步的研究予以证实。同时全长的Be82 抗原还存在一个缺陷，它与努巴贝斯虫存在交叉反应。

在随后的研究中，研究者［24］对全长的Be82 进行基因缺失克隆，构建了5 种不同基因缺失克隆株，逐个进行筛选，发现236 到381 位氨基酸的基因缺失克隆株产物，与谷光甘肽S-转移酶（GST）融合作为抗原包被，进行ELISA 试验，该试验具有非常好的特异性和敏感性，不与驽巴贝斯虫存在交叉反应，可以应用于ELISA 检测。

Be158 抗 原 是 近 期 新 发 现 的 抗 原［25］，编 码Be158 抗原的Be158 基因由1 个3510 核苷酸开放读码框组成。用在大肠杆菌中表达的Be158 基因产物作为ELISA 抗原，在小量标本范围内检测发现，该抗原具有较好的抗原特异性和敏感性，提示该抗原可以作为血清学诊断用抗原用于马巴贝斯虫ELISA 检测。

2.4 免疫色析法（BeICT）

免疫色析法由于引进免疫胶体金技术而得到开发和应用。免疫胶体金技术［26］是近年来一门新兴的实用技术，它是以胶体金作为示踪标志物应用于抗原抗体的一种新型的免疫标记技术。胶体金是由氯金酸（HAuCl4）在还原剂如白磷、抗坏血酸、枸橼酸钠、鞣酸等作用下，聚合成为特定大小的金颗粒，并由于静电作用成为一种稳定的胶体状态，称为胶体金。胶体金通过静电与蛋白质分子形成牢固结合，且不影响蛋白质的生物特性。根据胶体金的一些物理性状，如高电子密度、颗粒大小、形状及颜色反应，加上结合物的免疫和生物学特性，因而使胶体金广泛地应用于免疫学、组织学、病理学和细胞生物学等领域。

2004 年，Huang 等［27］首先建立了以重组rEMA-2t 抗原［21］为基础的免疫色析方法，用于快速检测马巴贝斯虫。该方法是一种基于硝酸纤维素膜（NC）的免疫方法。将重组rEMA-2t 抗原与胶体金结合，用0.05% 聚乙烯乙二醇20 000（PEG）和1% 牛血清白蛋白（BSA）稳定和封闭结合颗粒，用声处理后，再用0.5%BSA 和0.05%PEG 磷酸盐缓冲盐溶液洗涤、离心、悬浮，将结合物浓度调节至520 nm 下吸收值达到5 后，用含有5% 蔗糖10 mmol/L Tris-HCl（pH 8.2）稀释，涂抹在玻璃纤维上，真空干燥过夜。再将重组rEMA-2t 抗原及兔抗rEMA-2t IgG 线性均匀喷涂于NC 的试验区和对照区上，将NC 干燥、封闭、洗涤后，空气过夜干燥。将NC、吸收垫、结合垫、样品垫安置在粘性卡片上一起切割成条。用此条即可检测马巴贝斯虫感染。在样品垫加入100µl样品血清后，15 min 内就可以观察到检测结果，阳性样品在检测区域可以观察到一条清晰的沉淀线。用该方法对野外马血清进行检测，结果与ELISA 方法的符合率为96.7%，结果表明BeICT 是快速、简便、特异的，不与驽巴贝斯虫发生交叉反应。该方法较ELISA 方法更为简便、快捷，可以发现一些早期感染和潜伏感染的动物，由于不需要仪器和设备，更适用于野外检测马巴贝斯虫感染。

3 分子生物学检测技术

3.1 DNA 探针

目前，敏感而特异的马巴贝斯虫的DNA 探针已研究成功［28］。试验时，从血液中提取寄生虫DNA，在尼龙膜上点样，然后用相关的放射性DNA探针检查。探针法可以检出一些带虫动物，而且在对那些指定出口且要求无寄生虫感染的马匹进行检疫时，可以解决血清学试验中存在的问题。但因操作方法的局限性，目前不能被广泛采用。

3.2 聚合酶链反应（PCR）方法

PCR 方法已被广泛应用于实验室检测的各个方面。在对马巴贝斯虫检测方法的研究中，PCR 方法针对病原体进行检测，可以检出发病和带虫的马匹，并且其敏感性是ELISA 等试验无法比拟的，而且其特异性也是较高的，可以准确地与其它梨形虫进行区分，因而成为一大研究热点。当前，PCR 方法选择扩增的靶序列主要为EMA-1 基因和18s 核糖体RNA。

Farah 等［29］用两个合成的寡核苷酸引物特异性地扩增马巴贝斯虫EMA-1 基因中的819 bpsDNA片段的PCR 方法，对18 份来自埃及不同地区带虫但无马巴贝斯虫感染症状的马血清，进行了显微镜检查、间接荧光抗体试验（IFA）和PCR 试验。结果18 份带虫马血清样品经显微镜检查有7 份（38.8%）为阳性、IFA 检查有9 份（50%）为阳性，而PCR 检查有14 份（78%）为阳性。从而证明该PCR 是一种可用于常规检验慢性感染马巴贝斯虫的有价值的方法，尤其是在低寄生虫水平。

Nicolaiewsky 等［30］将EMA-1 作为扩增的靶序列，通过巢式PCR 的方法，得到102 bp 的马巴贝斯虫特异性片段。

Rampersad 等［31］以18S 核糖体RNA 作为目的序列，研究认为采用巢式PCR 的方法，可以将检测灵敏度提高50%以上。

Alhassan 等［32］建立了一种单循环多重PCR 诊断方法，该方法更简便，可同时检测马巴贝斯虫和驽巴贝斯虫。它是以18S 核糖体RNA 基因为靶基因，设计相同正义引物和不同的两套反义引物，在一个反应里，同时进行扩增马巴贝斯虫的540 bp 和驽巴贝斯虫的392 bpDNA 片段。这种方法对马巴贝斯虫的检测灵敏度可以达到0.018 个虫体。因此，单循环多重PCR 方法为常规诊断实验室和流行病学研究提供了一种区分马巴贝斯虫和驽巴贝斯虫的敏感、特异、简便的诊断方法。

4 生物学试验技术

4.1 血液再次接种

血清学试验中可能会遇到假阳性或假阴性反应［33-35］，在这种情况下采用全血接种易感动物进行传代试验，尽管烦琐、成本高，对确定真阳性马是一项非常有用的技术。将大量全血（500 ml）接种到易感马（最好已切除脾的）体内，尔后，观察马是否有该病的临床症状。采血涂片镜检，如果在其红细胞中检查到虫体，即可确诊。

另一种方法是让绝对无虫的洁净蜱叮咬可疑动物，然后检查蜱内是否有虫体存在，或通过蜱再将虫体传播给另一个易感动物来进行诊断。

4.2 体外培养

为鉴别带虫动物，进行马巴贝斯虫体外长期培养，可作为一种补充诊断方法，弥补上述试验的不足［35-38］。有人从未表现任何明显虫血症的马的血液，于培养初期即分离出了马巴贝斯虫［37，39］。

5 小结

以上各种方法各有优势，可根据具体情况采用不同的方法或几种方法联合应用。随着免疫学和分子生物学的迅猛发展，研究会更加深入，未来会有更多的先进技术方法应用于马巴贝斯虫的诊断，为畜牧业和进出口贸易以及人类的健康发展创造良好的条件。